Contribution à l'étude du système lipolytique d'un animal primitif marin: le crabe vert

Conclusion et Perspectives

Dans ce présent travail, la purification et la caractérisation biochimique partielle de la lipase digestive de crabe (LDC) ont été réalisées.

Nos résultats montrent que :

§ La masse moléculaire de la LDC est de 65 kDa.

§ Contrairement à toutes les lipases de règne animal, La température optimale d'action de la LDC est de 60°C.

§ La cinétique d'hydrolyse d'une émulsion d'huile d'olive ou de tributyrine reste linéaire pendant 20 min.

§ L'activité spécifique de la LDC purifiée est de 500 UI/mg sur la tributyrine comme substrat.

§ Le calcium n'est pas nécessaire pour déclencher l'activité lipasique.

§ La LDC est stable et active entre pH 6 et 10 après 30 min d'incubation à température ambiante.

§ Le NaDC inhibe la LDC à une concentration de 2 mM.

§ Les résultats d'immunoréactivité de la LDC vis-à-vis de deux types d'anticorps polyclonaux anti-SDL et anti-TPL suggèrent que la LDC ne présente pas d'homologie structurale ni avec les lipases pancréatiques classiques ni avec une lipase d'un arthropode terrestre (le scorpion).

Perspectives :

§ Déterminer la séquence primaire de la LDC.

§ Déterminer et exprimer le gène qui code pour la LDC.

§ Modéliser ou cristalliser la LDC pour déterminer la structure tertiaire.

§ Approfondir l'étude immunologique.

Sommaire

Introduction 1

Etude bibliographique

I- Les enzymes lipolytiques 2

1- Introduction 2

2- Cinétique enzymatique de la lipolyse 2

II- Les lipases du monde marin 4

III- Les Crabes 5

1- Position systématique 5

2- Morphologie des crabes 5

3- Système digestif 5

Matériel & Méthodes

I- Matériel 7

1- Réactifs 7

2- Animaux 7

3- Protéines 7

4- Supports chromatographiques 7

5- Appareillage 7

II- Méthodes 7

1- Dosage de l'activité lipolytique 7

2- Dosage de l'activité phospholipasique 8

3- Détermination de la concentration en protéines 8

4- Effet de la température sur l'activité lipasique 8

5- Effet du pH sur l'activité lipasique 8

6- Stabilité de la lipase de crabe en fonction de la température 8

7- Stabilité de la lipase de crabe en fonction du pH 8

8- Effet des ions calcium 9

9- Effet du détergent naturel sur l'activité lipasique 9

10- Dosage des sels biliaires dans l'hépatopancréas de crabe 9

a) Préparation de la solution (Enzyme/NAD⁺) au moment de l'expérience 9

b) Dosage des échantillons 9

11-Analyse des protéines par électrophorèse et immunorévélation 9

Résultats & Discussion

I- Niveau des enzymes lipolytiques et de la colipase dans l'hépatopancréas de crabe vert 10

1- Mise au point des activités lipasique et phospholipasique dans l'homogénat 10

2- Recherche de la colipase dans l'hépatopancréas de crabe 10

3- Recherche de sels biliaires dans l'hépatopancréas de crabe 11

II. Purification de la lipase de crabe vert 11

Préparation de l'homogénat 11

1- Traitement à 60°C 11

2- Chromatographie échangeuse d'anions 11

3- Précipitation au sulfate d'ammonium 11

4- Filtration sur Séphacryl S-200 12

5- Chromatographie échangeuse d'anions : Mono Q-Sépharose 12

6- Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS 13

7- Bilan de purification de la lipase de crabe vert 14

III- Caractérisation biochimique de la lipase digestive de crabe vert 14

1- Activité lipasique en fonction de la température 14

2- Cinétique d'hydrolyse de la tributyrine et de l'huile d'olive 15

3- Effet du pH sur l'activité de la LDC 15

4- Stabilité de la LDC en fonction de pH 16

5- Effet de la température sur l'activité de la LDC 16

6- Stabilité de la LDC en fonction de la température 17

7- Effet de calcium sur l'activité de la LDC 17

8- Effet d'un composé amphipatique sur l'activité de la LDC 18

9- Immunoréactivité des anticorps polyclonaux anti-SDL et anti-TPL avec la LDC 19

Conclusion & Perspectives

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