II- Méthodes
1- Dosage de l'activité
lipolytique
L'activité lipolytique est mesurée à pH 8
par titration des acides gras libérés avec du NaOH 100 mM
à l'aide d'un pH-Stat (Gargouri et al., 1986). Le substrat
utilisé est une
émulsion d'huile d'olive à 10 % (10 ml d'huile
d'olive dans 90 ml de gomme arabique à 10 %), le test contient 10 ml
d'émulsion, 20 ml d'eau distillé. Dans le cas du test avec la
tributyrine (TC4), le milieu de dosage standard contient 250 ul de
TC4 dans 30 ml tampon Tris-HCl 2 mM, pH 8. L'activité
enzymatique est exprimée en unité internationale (UI). Une
unité d'activité lipolytique correspond à la
libération d'une umole d'acide gras par minute.
2- Dosage de l'activité phospholipasique
L'activité phospholipasique est mesurée à
l'aide d'un pH-stat, à pH 8 et à 60°C par titration des
acides gras libérés avec NaOH 100 mM, suite à l'hydrolyse
du substrat . Le substrat utilisé est une émulsion de
phosphatidylcholine. Le test contient 10 ml d'émulsion et 20 ml tampon
Tris-HCl 2 mM, DOC 6 mM et CaCl2 7 mM. L'activité phospholipasique est
exprimée en unité enzymatique qui correspond à la
libération d'une micromole d'acides gras par minute.
3- Détermination de
la concentration en protéines
La concentration de protéines est
déterminée selon la méthode spectrophotométrique
décrite par Bradford (1976) en utilisant le sérum albumine bovine
comme standard, dont le coefficient d'extinction molaire
E1%1cm est de 6,7.
4- Effet de la
température sur l'activité lipasique
L'influence de la température sur l'activité de
l'enzyme a été étudiée en mesurant
l'activité à pH 8 et à différentes
températures en utilisant la tributyrine comme substrat.
5- Effet du pH sur
l'activité lipasique
L'activité lipasique est mesurée sur une
émulsion de tributyrine à température optimale et à
différents pH.
6- Stabilité de la
lipase de crabe en fonction de la température
La stabilité de l'enzyme en fonction de la
température a été étudiée en incubant
l'enzyme à différentes températures pendant 10 min.
Après centrifugation l'activité lipasique est mesurée dans
le surnageant dans les conditions optimales.
7- Stabilité de la
lipase de crabe en fonction du pH
L'enzyme a été incubé à
différents pH variant de 3 à 10 en utilisant différents
tampons. Après 10 min d'incubation, l'échantillon est
centrifugé pendant 5 min à 10 000 rpm et
l'activité lipasique est mesurée dans les conditions optimales
dans le surnageant.
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