11-Analyse des
protéines par électrophorèse et
immunorévélation
La pureté des protéines est suivie par
électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 12 %, en
présence de dodécylsulfate de sodium (SDS) (Laemmli, 1970).
Pour l'immunorévélation, les protéines
sont électrotransférées sur une membrane de
nitrocellulose à partir du gel de polyacrylamide, pendant 1heure sous
une tension de 220V, dans un tampon 20 mM Tris-HCl, 150 mM glycine et 20 % de
méthanol. La qualité de transfert est vérifiée par
coloration transitoire des protéines au rouge ponceau (0,2% dans l'acide
trichloracétique 3 %). Pour empêcher toute fixation non
spécifique des anticorps, la membrane est préalablement
saturée par incubation pendant 1heure dans une solution contenant 3 %
de poudre de lait lyophilisé (Régilait, Nestlé) dans le
tampon PBS-Tween 20 (8 g/l NaCl ; 0,1 g/l KH2PO4. ; 2,9 g/l
Na2HPO4,2H2O ; 0,05 % Tween 20), à
température ambiante. Après plusieurs lavages avec le tampon
PBS-Tween 20, la membrane est incubée pendant 1heure à
température ambiante avec l'anticorps anti-SDL ou anti-TPL (2ug/ml).
L'excès d'anticorps est ensuite éliminé par trois
lavages de 10 min avec le tampon PBS-Tween 20. Après le dernier
lavage, la membrane est incubée pendant 1heure avec un deuxième
anticorps anti-IgG couplé à la phosphatase alcaline (Sigma) et
dilué au 1/2000 dans le tampon PBS-Tween 20. Ce deuxième
anticorps est spécifique des IgG de lapin. La membrane est ensuite
lavée trois fois avec le tampon PBS-Tween 20 et deux fois avec un tampon
0,1M Tris-HCl, 0,1M NaCl, 1mM MgCl2, 5mM
5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate alcalin avec son substrat qui
génère un précipité violet sur la membrane au
niveau des bandes reconnues. La réaction est arrêtée par
plusieurs lavages avec de l'eau distillée.
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