|
Cytotoxicité larvaire et activités antimicrobiennes des extraits de Adansonia digitata L., Tamarindus indica L. et de Acacia nilotica L. delile sur des souches microbiennes multirésistantes au Béninpar Afoussatou AMADOU Universite d'Abomey Calavi - Master en Microbiologie Moleculaire et medicale 2022 |
MEMOIRE DE FIN DE FORMATION POUR L'OBTENTION DU DIPLÔME DE MASTER EN MICROBIOLOGIE MOLECULAIRE ET MEDICALE (MASTER-3M) Cytotoxicité larvaire et activités antimicrobiennes des extraits de Adansonia digitata L., Tamarindus indica L.et de Acacia nilotica L. Delilesur des souches microbiennes multirésistantes au Bénin THEME Réalisé par : AMADOU Afoussatou Directeur : Dr (MC) Jean Robert KLOTOE Physiologiste-Pharmacologue Maître de Conférences des Universités (CAMES), Enseignant-Chercheur aÌ l'Ecole Nationale des Sciences de Natitingou/UNSTIM Membres du jury Président du jury : Pr BANKOLE S. Honoré, Professeur titulaire des Universités du CAMES, Rapporteur : Dr Jean Robert KLOTOE,Maître de Conférences en Physiologie-Pharmacologie, ENS Natitingou/UNSTIM Examinateur : Dr DEGBE Cyriaque, Maître-assistant des Université du CAMES, Bénin Année Académique : 2021-2022 2ème Promotion
Mon père AMADOU Abdou Razack et ma mère ALEDJI Naïmath Augustine, Je leurdédie ce travail pour leur dur labeur, l'amour et la protection qu'ils m'accordent. Que Dieu les protège, veille sur eux et leur accorde une longue vie afin qu'ils jouissent de leurs efforts. Honorables respects et profondes gratitudes à vous. Ce travail de recherche est le fruit de nombreuses collaborations pluridisciplinaires. Il se situe à la frontière entre la microbiologie, la biologie moléculaire et la pharmacologie ayant une finalité thérapeutique. · Dieu le Père, le Tout Puissant, qui m'a donné la force et la patience d'accomplir ce modeste travail. Lui qui a toujours été mon guide et soutien, qui me comble chaque jour au-delà de mes espérances et sans qui je ne suis rien. Que son nom soit glorifié. Mes chaleureux remerciements et reconnaissances à tous ceux qui ont apporté leur concours à la réalisation de ce mémoire en occurrence : · Au directeur du mémoire Dr KLOTOE Jean Robert, Maître deConférences (CAMES)en Physiologie-Pharmacologie, Pour votre disponibilité, compréhension, et avoir accepté de diriger ce travail. J'ai beaucoup appris de vous grâce à votre patience et humilité qui m'ont toujours impressionnée. Trouvez ici le témoignage de ma profonde gratitude et de ma reconnaissance. · Dr DOUGNON Victorien Tamègnon, Maître-Assistant en Microbiologie, Pour le choix de la formation et l'accompagnement dans mon cursus universitaire et de recherche. Trouvez ici le témoignage de ma profonde gratitude et de ma reconnaissance. · M. FANOU Brice, Pour la sympathie, la simplicité et l'amour du travail. Puissiez trouver ici mes sincères gratitudes pour votre contribution à ce travail. · Dr AGBANKPE Jerrold, Dr FAH Lauris, Dr DEGUENON Esther, Dr KOUDOKPON Hornel, Dr AGBODJENTO Eric, Dr AYENA Césaire, Dr SOHA Arnaud, Dr LEGBA Boris, M. OHOUKO Fréjus, Pour la sympathie, simplicité et l'amour du travail. Puissiez trouver ici mes sincères gratitudes pour votre contribution à ce travail. · Aux enseignants et à tous les membres de l'administration de l'Unité de Recherche en Microbiologie Appliquée et Pharmacologie des substances naturelles (URMAPha), Pour leur aide au bon déroulement de la formation. · Aux membres de l'Unité de Recherche en Microbiologie Appliquée et Pharmacologie des substances naturelles en occurrence ASSOGBA Phénix, FABIYI Kafayath, HOUNSA Edna, ANIAMBOSSOU Alidah, GBOTHE Elodie, GBAGUIDI Candide, SINTONDJI Kévin, DANSI SOCLO Flocas, CODJIA Ida, BALARABE Roubaya, AKOTEGNON Rémi, SOVEGNON Toussaint, HOUNKANRIN Manoir, HOUEDJISSIN Jaurès, VODOUNNON Kévine, AHOUANDJINOU Sophonia, Pour l'ambiance harmonieuse qui règne entre nous,pour votre contribution dans la réalisation de ce travail. Longue vie à l'équipe. · Mon Grand-père AMADOU Djibril, Un homme unique, sage, rempli de bonté et de bienveillance. Merci pour tes prières et ton amour. Que Dieu puisse t'accorder une longue vie. · Ma grande soeur Mme BOUKARY AMADOU Nassiratou et son époux M. BOUKARY Bio Habib, Pour leur hospitalité, leurs soutiens financier et moral, leurs conseils et encouragements. Puisse Dieu vous le leur rendre au centuple. Toute ma gratitude. · Mes frères et soeursFalilath, Saliou, Issa, Mouhamed, Amidath, Aimane, Abdoul Aziz, Akim, Madjidou sans oublier mes neveux Abchir, Mafouz, Raghdane et nièces Rifaat, Himayath et Rafiath. Pour votre soutien moral, trouvez ici l'expression de la complicité et de l'affection qui nous ont toujours liées. Plein succès à vous. · SARRE KOTO Wadjid, TCHANKPAN Franchesco Fred et YACOUBOU Aminath, · Pour leurs amitiés inconditionnelles, leurs conseils et sincérités. Du fond du coeur, merci. · AFATON Anny, DJOHOUN Yédia, HOUEFONDE Merveille, GABA Hosanna, ALODE Rosette, HOUEFONDE Adonias,ADJAHI Alda, Pour l'aide technique dans l'accomplissement de ces travaux. Mes sincères remerciements. · Tous mes condisciplesde formation et tous ceux qui de près ou de loin ont contribué à la réalisation de ce travail, Je leur présente mes sincères remerciements. ü A son Excellence le Président du Jury, C'est un grand honneur que vous nous faites en acceptant de présider notre Jury de soutenance de mémoire de fin de formation. Vos remarques et contributions seront prises en compte pour améliorer la qualité de ce travail. Respectueux Hommages?! ü Aux Honorables Membres du Jury, Nous sommes touchée par l'honneur que vous nous faites en acceptant de siéger dans notre Jury de soutenance du mémoire de fin de formation. Profonde gratitude et sincères considérations?!
Tableau I : Taxonomie de Adansonia digitata L. (Azad, 2018) 3 Tableau II : Utilisations ethnomédicales de Adansonia digitata L. 12 Tableau III : Classificaition taxonomique de Tamarindus indica L. 17 Tableau IV : Utilisation traditionnelle 19 Tableau V : Classification taxonomique de Acacia nilotica (L.) Willd. ancien Delile 24 Tableau VI : Correspondance entre CL50 et toxicité 33 Tableau VII : Profil de résistance des souches bactériennes multirésistantes utilisées 34 Tableau VIII : Profil des gènes de résistance des souches bactériennes multirésistantes utilisées 34 Tableau IX : Interprétation des mesures de diamètre d'inhibition 35 Tableau X : Profil des souches fongiques utilisées 36 Tableau XI : Facteurs de virulence des souches fongiques 36 Tableau XII : Aspects de souches de Candida sur milieu ChromAgar Candida (Conda, Espagne) et sur milieu TRM. 37 Tableau XIII : Norme utilisée pour la lecture des résultats des tests d'antibiogramme des extraits végétaux. 40 Tableau XIV : CL50 des extraits de plante 48 Tableau XV : Activité antibactérienne des extraits aqueux et éthanolique des différentes parties de Adansonia digitata sur les souches bactériennes multirésistantes 50 Tableau XVI : Activité antifongique des extraits aqueux et éthanolique des différentes parties de Adansonia digitata sur les souches de Candida 51 Tableau XVII : Activité antibactérienne des extraits aqueux et éthanolique des différentes parties de Tamarindus indica sur les souches bactériennes multirésistantes 52 Tableau XVIII : Activité antifongique des extraits aqueux et éthanolique des différentes parties de Tamarindus indicasur les souches de Candida 53 Tableau XIX : Activité antibactérienne des extraits aqueux et éthanolique des différentes parties de Acacia nilotica sur les souches bactériennes multirésistantes 54 Tableau XX : Activité antifongique des extraits aqueux et éthanolique des différentes parties de Acacia nilotica sur les souches deCandida 55 Tableau XXI : CMI, CMB et du pouvoir antibiotique des extraits de plante 66 Tableau XXII : CMI, CMF et du pouvoir antifongique des extraits de plante 67 Figure 1 : Baobab ou Adansonia digitata L. 3 Figure 2. Représentation des activités pharmacologiques de Adansonia digitata 15 Figure 3 : Tamarindus indica (fruits & écorces). 18 Figure 4 : Propriétés pharmacologiques de Tamarindus indica 21 Figure 5 : Acacia nilotica (L.) Willd. ancien Delile 24 Figure 6 : Propriétés pharmacologiques de Acacia nilotica (L.) Willd. ancien Delile 26 Figure 7 : Illustration de la méthode d'évaluation du pouvoir antimicrobienne des extraits de plante étudiés (Cas d'un extrait aqueux) 40 Figure 8 : Rendement à l'extraction des plantes étudiées 44 Figure 9 : Sensibilité des larves de Artemia salina aux extraits de Acacia nilotica 45 Figure 10 : Sensibilité des larves de Artemia salina aux extraits Adansonia digitata 46 Figure 11 : Sensibilité des larves de Artemia salina aux Tamarindus indica 47 Figure 12 : Pourcentage d'activité antibactérienne des différents extraits des différentes plantes étudiées sur les bactéries présentant le gène mecA 56 Figure 13a : Pourcentage d'activité antibactérienne des différents extraits des différentes plantes étudiées sur les bactéries présentant le gène BlaSHV 56 Figure 14 : Pourcentage d'activité antifongique des différents extraits des différentes plantes étudiées sur les champignons présentant la résistance au fluconazole 60 Figure 15a : Pourcentage d'activité antifongique des différents extraits des différentes plantes étudiées sur les champignons présentant la virulence au facteur lécithinase 61 Figure 16 a : Pourcentage de déstabilisation des extraits de plante sur la membrane des souches S. aureus résistantes à la méthiciline en fonction des concentrations 68 La résistance aux antimicrobiensdemeure une préoccupation majeure de santé publique. Les plantes médicinales constituent l'une des alternatives pour la découverte de nouvelles molécules antimicrobiennes efficaces et sûres. Au Bénin, Adansonia digitata L., Tamarindus indica L. et Acacia nilotica (L) Delile sont trois plantes utilisées traditionnellement pour le traitement des infections. Cette étude a visée à contribuer à la lutte contre la résistance aux antimicrobiens au Bénin. L'étude a porté sur les extraits aqueux et éthanolique des feuilles, écorces et fruits des plantes sélectionnées. La cytotoxicité larvaire a été évaluée par la sensibilité des larves de Artemia salina aux extraits préparés. Les tests antibactériens et antifongiques ont été réalisés par la méthode de diffusion sur gélose des extraits sur les souches bactériennes résistantes de Staphylocoque à Coagulase Négative (SCN), Staphylococcus. aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloacae et les souches fongiques de Candidaalbicans, Candidakrusei, Candidaparapsilosis,Candidaglabrata. Ensuite, les Concentrations Minimales Inhibitrices (CMI), Bactéricides (CMB) et Fongicides (CMF) ont été déterminées par la méthode de micro-dilution pour les deux extraits les plus actifssur les souches testées. Le mécanisme d'action de l'effet antimicrobien des extraits actifs a été recherché par la méthode d'action sur la membrane cytoplasmique. Les résultats obtenus ont indiqué une absence de cytotoxicité larvaire des différents extraits testés à l'exception des extraits de fruits et de feuilles de A. digitata qui ont présenté une toxicité modérée. Concernant l'activité antibactérienne, les souches de Staphylocoque à Coagulase Négative (SCN) et S. aureus résistantes à la méticilline ont été inhibées par la plupart des extraits testés. Sur les souches entéropathogènes, les extraits aqueux des fruits des plantes testées ont inhibé la croissance de la totalité des souches testées. En plus de cet extrait, l'extrait éthanolique d'écorce de T. indica a inhibé la croissance de toutes ces souches à l'exception de K. pneumoniae. De même, respectivement les extraits éthanoliques du fruit de A. nilotica et de A. digitata ont été actifs sur les souches entéropathogènes. Concernant l'activité anti-candidosique, seuls les extraits aqueux des fruits et feuilles de A. nilotica, de même, l'extrait éthanolique de l'écorce de A. digitata ont présenté une activité antifongique sur la majorité des souches fongiques testées. Les données obtenues sur le mécanisme d'action ont mis en évidence le potentiel de déstabilisation de la membrane des souches bactériennes des extraits testés avec un meilleur effet par rapport à l'Imipénème utilisé comme molécule de référence. Ces données mettent en lumière le potentiel antimicrobien des plantes étudiées et justifient leur usage en médecine traditionnelle. Mots clés : Antimicrobien?; Candida?; Entérobactérie?; plante médicinale, Bénin Antimicrobial resistance remains a major public health concern. Medicinal plants are one of the alternatives for the discovery of new effective and safe antimicrobial molecules. In Benin, Adansonia digitata L., Tamarindus indica L. and Acacia nilotica (L) Delile are three plants traditionally used for the treatment of infections. This study aimed to contribute to the fight against antimicrobial resistance in Benin. The study focused on the aqueous and ethanolic extracts of the leaves, barks and fruits of the selected plants. Larval cytotoxicity was assessed by sensitivity of Artemia salina larvae to the prepared extracts. Antibacterial and antifungal tests were performed by agar diffusion method of the extracts on resistant bacterial strains of Coagulase Negative Staphylococcus (CNS), Staphylococcus. aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloacae and fungal strains of Candida albicans, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida glabrata. Then, the Minimum Inhibitory Concentrations (MIC), Bactericides (BMC) and Fungicides (FMC) were determined by the micro-dilution method for the two most active extracts on the tested strains. The mechanism of action of the antimicrobial effect of the active extracts was investigated by the cytoplasmic membrane action method. The results obtained indicated no larval cytotoxicity of the different extracts tested except for the fruit and leaf extracts of A. digitata which showed a moderate toxicity. Concerning the antibacterial activity, the strains of Coagulase Negative Staphylococcus (SCN) and S. aureus resistant to methicillin were inhibited by most of the tested extracts. On enteropathogenic strains, aqueous extracts from the fruits of the plants tested inhibited the growth of all the strains tested. Besides this extract, the ethanolic extract of T. indica bark inhibited the growth of all these strains except K. pneumoniae. Similarly, ethanolic extracts of the fruit of A. nilotica and A. digitata were active on enteropathogenic strains respectively. Concerning the anti-candidus activity, only the aqueous extracts of the fruits and leaves of A. nilotica, and the ethanolic extract of the bark of A. digitata showed antifungal activity on the majority of the fungal strains tested. The data obtained on the mechanism of action highlighted the membrane destabilization potential of the bacterial strains of the tested extracts with a better effect compared to Imipenem used as reference molecule. These data highlight the antimicrobial potential of the studied plants and justify their use in traditional medicine. Key words: Antimicrobial; Candida; Enterobacteria; medicinal plant, Benin. SOMMAIRE
L'émergence de la résistance aux antimicrobiens (RAM) constitue un réel problème de santé publique dans le monde (Maurizio et al., 2017). Elle est observée dans les domaines sanitaire et environnemental-(Essack et al., 2016). Selon l'OMS, en Afrique, la charge de morbidité liée à la résistance aux antimicrobiens est marquée essentiellement par l'augmentation de la mortalité, du taux d'admission aux soins intensifs et la durée de séjour en établissement de soins (Ogbolu et al., 2011 -; Essack et al., 2016). Très observée au sein des bactéries, leur impact n'est pas négligeable sur les autres microorganismes dont particulièrement les champignons. Au rang des bactéries en Afrique subsaharienne, selon une étude de l'Organisation Mondiale de la Santé, une forte résistance a été observée au niveau des familles d'antibiotiques telles que : les céphalosporines, les fluoroquinolones et les carbapénèmes sur les souches de Escherichia coli etKlebsiella pneumoniae.De même, la majoritédes souches de Staphylococcus aureusa également développé une résistante à la méticilline (OMS, 2014). Cette remarque s'est faite aussi au niveau des espèces fongiques. En effet, entre 2000 et 2014, la prévalence a été doublée avec une tendancecroissante au cours de ces dernières années(Alanio et al., 2014). Les azolés représentent les antifongiques ayant présenté les plus forts taux de résistance. D'après Alanio, entre 2000 et 2014, il a été rapporté que 31 % des isolats de C. glabrata étaient résistants au fluconazole, habituellement très actif sur les souches fongiques(Alanio et al., 2014). Pour faire face à la RAM, la recherche de nouvelles moléculesantimicrobiennes s'avère nécessaire. Des efforts sont orientés vers les plantes médicinales au pouvoir antimicrobien. Dans ce sens, la recherche de molécules bioactives extraites des plantes médicinales constitueunealternative prometteuse.Parmi ces dernières, Acacia nilotica, Tamarindus indica et Adansonia digitata '''''''''''''' (Diattaet al.,2019; Datsugwai et Yusuf, 2017; Kumar et al., 2015; Escalona Arranz et al.,2010) sont trois espècesdont les parties feuilles, écorces et fruits ont été indiquées dans le traitementdes infections.Les multiples vertus des parties de ces plantes attestées par des études scientifiques montrent leurs potentiels thérapeutiques- -'''(Abdelrhman et Adam, 2020; Ajiboye et al., 2020; Akoma et al., 2018; Escalona-Arranz et al., 2016; Eyong et al., 2015; Ambe et al., 2015). Ce potentiel serait expliqué par l'effet des composés chimiques présents dans les parties de plante et quantitativement variables selon le type de solvant utilisé pour l'extraction(Abdalla et al., 2020 ; Datsugwai et Yusuf, 2017).Les études phytochimiques effectuées sur Adansonia digitata ont mis en évidence la richesse de cette plante en leucoanthocyanines, glycosides, stéroïdes, stérols, polyterpènes, alcaloïdes et saponines (Datsugwai et Yusuf, 2017; Braca et al., 2018). La plupart de ces composés chimiques ont été identifiés dans Tamarindus indica-(Adeniyi et al., 2017; Mehdi et al., 2019). Par ailleurs, 'Lebri et al. (2015) ont mentionné que la présence des alcaloïdes à une dose élevée serait à l'origine de la toxicité de la plante. Les études scientifiques effectuées sur les plantes (Acacia nilotica, Tamarindus indica et Adansonia digitata) ont prouvé leurs effets antimicrobiens sur des travaux sur des souches de références et des souches cliniques -(Assam et al., 2020?; Essack et al., 2016?; Escalona-Arranz et al., 2010). Du fait des vertus thérapeutiques attribuées à ces plantes dans la lutte antimicrobienne et de l'existence d'une probable toxicité à une certaine dose après consommation, il est nécessaire de se poser les questions suivantes : est-il possible que l'activité biologique d'une plante médicinale variesuivant ses différentes parties?? L'effet antibactérien des plantes médicinales peut-il varier suivant les profils de résistance des souches étudiées?? Les limitesd'investigation scientifique sur l'évaluation des effets antimicrobiens permettraient-elles d'aller vers l'élucidation du mécanisme d'action de l'effet antibactérien de ces plantes?? Dans l'optique de répondre à ces questions, la présente étude vise en objectif général à contribuer à la lutte contre la résistance aux antimicrobiens au Bénin.Spécifiquement, il s'est agi de : - explorer les activités antibactérienne et antifongique des extraits de différentes parties des plantes sélectionnées sur des souches présentant différents profils de résistance et de virulence?; - déterminer le degré de cytotoxicité des extraits des différentes parties de ces plantes sur les larves de Artemia salina Leach?; - rechercher le mécanisme d'action de l'effet antimicrobien des extraits les plus actifs sur les souches testées. I. SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE |
|
