2.3.3 Evaluation de l'activité antimicrobienne des
extraits des plantes
Dans cette partie de l'étude, le profil de
résistance aux antifongiquesdes souches cliniques isolées de
prélèvements des sécrétions cervico-vaginales et
des urines a été déterminé. Pour ce faire, les
souches jeunes obtenues après culture de 24 h sur la gélose
Potatose Dextrose Agar (PDA) ont été utilisées.
2.3.3.1. Confirmation des souches cliniques
Les souches présentant un profil de résistance
aux antibiotiques ont été vérifiées à la
biologie moléculaire pour la détermination des gènes de
résistance ont été confirmées par des tests
morphologiques (Gram contrôle) et des tests biochimiques de galerie de
Leminor. Le profil de résistance des souches a été
confirmé par la réalisation des tests l'antibiogramme avec les
disques concernés.
L'identification des levures a été
effectuée selon la méthode décrite par Ghaddar et al.
(2020) et légèrement modifiée. Elle se base sur
l'étude de l'aspect morphologique des souches à l'examen direct
sur milieu gélosé et la recherche de la production de tube
germinatif in vitro.
En effet, chaque isolat a d'abord
été examiné à l'examen direct dans une solution
physiologique entre lame et lamelle. Ensuite, le test de filamentation (test de
blastèse) consistant à incuber l'isolat dans du sérum
à 37 °C pendant trois (3 h) a été
réalisé pour chaque isolat. Enfin, les aspects des colonies
produites sur le milieu ChromAgar Candida (Conda, Espagne)
couplés de la réduction du sel de Tétrazolium sur milieu
Sabouraud au Tétrazolium (TRM ou Tetrazolium réduction Medium)
ont été notés (Tableau XII) après 24 h
à 48 h d'incubation à 37 °C.
Tableau XII : Aspects de souches de Candida
sur milieu ChromAgar Candida (Conda, Espagne) et sur milieu
TRM.
|
Espèces fongiques
|
Couleur au ChromAgar
|
Couleur au TRM
|
|
|
|
|
C. albicans
|
Vert clair
|
Rose pâle et luisant parfois à centre marron
|
|
C. glabrata
|
Rose luisant
|
Rose luisant (croissance lente)
|
|
C. krusei
|
Rose pâle à bord blanchâtre
|
Rose mât
|
|
C. parapsilosis
|
Beige ou jaunâtre
|
Rose violacé
|
|
|
|
2.3.3.2. Test d'activité antifongique des extraits de
plantes
L'identification des extraits actifs a été faite
par la méthode de diffusion en milieu solide selon Alsubhi et al.
(2019) et la détermination des concentrations minimales
inhibitrices (CMI) et fongicide (CMF) par la méthode de microdilution
selon Lagane (2007).
Préparation des milieux de culture
La gélose PDA a été
préparée, stérilisée, puis coulée dans les
boîtes de Pétri.
Préparation des suspensions
fongiques
Deux colonies moyennes de 24 h de la souche à
tester ont été cultivées sur gélose PDA et
prélevées et émulsionnées dans 5 ml de
solution saline à 9 %o. Les suspensions fongiques ainsi
préparées ont été ajustées à la
densité 0,5Mc Farland correspondant à 1,5X105UFC/mL.
Préparation des dilutions d'extraits
100 mg de chaque extrait a été
pesé et dissous complètement dans 1000 uL d'eau
distillée stérile. La suspension ainsi préparée a
ensuite été bien vortexée avant chaque utilisation.
Activité antifongique proprement
dite
En effet, deux plaques gélosées de Potatose
Dextrose Agar (PDA) ont été ensemencées avec la suspension
fongique préparée pour chaque type d'extrait. Six puits de
7 mm de diamètre ont ensuite été
réalisés de façon stérile dans les milieux
gélosés à l'aide de pipette Pasteur. Les cinq puits
périphériques ont servi de puits tests et le puits central
utilisé pour le contrôle négatif. Ainsi, 100 uL de
chaque extrait (Extraits aqueux ou hydro éthanolique) a
été mis dans les puits et 100 uL de Clotrimazole (CLT)
(100 ug/ml) dans les deux suivants dont un pour le témoin positif,
puis 100 uL d'eau distillée dans le second puits contrôle
négatif. Les plaques ainsi traitées ont été
couvertes, laissées deux heures sur la paillasse puis incubées
à 37 °C pendant 24 h. Les diamètres d'inhibition
observés autour des puits après l'incubation ont ensuite
été mesurés à l'aide d'un
doubledécimètre pour chaque type d'extrait étudié.
L'extrait le plus actif correspond à celui ayant présenté
le plus grand diamètre d'inhibition.
La détermination des concentrations minimales
inhibitrices (CMI) a été faite en milieu liquide selon Lavaee
et al. (2019). Les tests ont été réalisés
sur des dilutions successives (1/2?; 1/4?; 1/8?; 1/16?; et 1/32) d'extrait.
100 uL de chaque extrait dilué ont ensuite été
déposés dans les puits réalisés sur la
gélose PDA contenant la souche de 24H précédemment
ensemencée. Après 45 min de diffusion sur paillasse, les
boîtes de gélose ont été incubées à
37 °C pendant 24heures. Un témoin positif en remplacement de
l'extrait au Clotrimazole (CLT) a été mélangé
à l'inoculum fongique et pour le témoin négatif, seule
l'eau distillée stérile a été mise en contact avec
les puits. Cette partie de l'étude a été
réalisée suivant la méthode appliquée par
Lègba et al. (2017).
| 
