Clonage et expression de la protéine CFP10 de Mycobactérium Tuberculosis dans Pichia Pastoris

• Introduction :
  
  • I.2) Vecteur de clonage et d'expression.............................................25
    
  • I.3) Les enzymes.......................................................................26
    
  • I.4) Les marqueurs de poids moléculaires..........................................27
    
  • I.5) Les oligonucléotides..............................................................28
    
  • I.6) Autres matériels...................................................................28
    
  • II.1) PCR.................................................................................29
    
  • II.2) Electrophorèse sur gel d'agarose...............................................29
    
  • II.3) Purification d'ADN sur gel d'agarose.........................................30
    
  • II.4) La digestion.......................................................................30
    
  • II.5) La ligation........................................................................31
    
  • II.6) Transformation des bactéries...................................................31
    
  • II.7) Colonie PCR.....................................................................32
    
  • II.8) Préparation des plasmides......................................................32
    
  • II.9) Eléctroporation de la levure Pichia pastoris..................................33
    
  • II.10) Production de la protéine recombinante dans Pichia pastoris............33
    
  • II.11) Electrophorèse des protéines sur gel polyacrylamide en présence de
    
  • II.12) Immunoblot et révélation par ECL................................................35
    
  • I.1) Stratégie de clonage...............................................................37
    
  • I.2) PCR..................................................................................38
    
  • I.3) Digestion et purification du produit PCR et du plasmide pPICZáA........39
    
  • I.4) Ligation et transformation des bactéries compétentes E-coli top 10 f'....40
    
  • I.5) Colonie PCR........................................................................41
    
  • I.6) Carte de restriction de plasmide recombinant.................................41
    
  • I.7) Séquençage automatique.........................................................42
    
  • II.1) Linéarisation de pPICZáA / Rv3874..........................................43
    
  • II.3) Production de la protéine recombinante CFP10-myc epitope-6his.........44
    
  • II.4) Identification de la protéine recombinante par western blot................45
    
• II.1) Choix des hôtes cellulaires :
  
• II.2) Choix du vecteur d'expression :
  
  • III.1) Les hôtes utilisés pour la production des protéines recombinantes :
    
• III.1.1) E. coli :
  
• III.1.2) Saccharomyces cerevisiae :
  
• III.1.3) Les cellules CHO (Chinese Hamster Ovary)
  
• III.1.4) D'autres bactéries :
  
  • III.1.5) D'autres levures et champignons filamenteux :
    
• III.1.6) Les plantes transgéniques :
  
  • III.1.7) Les animaux transgéniques :
    
• III.2) Les vecteurs et cassettes d'expression :
  
  • IV.1) Principaux avantages du système :
    
• IV.2) Le métabolisme du méthanol :
  
  • V.1) Les vecteurs d'expression :
    
• V.2) Mode d'intégration du gène d'intérêt :
  
• V.3) Le nombre de copies de la cassette d'expression :
  
• V.4) Modifications post traductionnelles chez Pichia pastoris :
  
• V.5) Les facteurs agissant sur la cinétique de croissance de Pichia pastoris :
  
• V.6) Les facteurs agissant sur la cinétique de production :
  
• VI.1) Les bacilles de la tuberculose :
  
• VI.2) Pouvoir pathogène de M. tuberculosis :
  
• VI.3) Diagnostic bactériologique :
  
• VI.4) Séquençage de génome de la souche H37Rv :
  
• VI.5) Le gène Rv3874 et l'antigène CFP10 :
  
  • I.1) Souches Bactériennes et levures utilisées :
    
  • I.2) Vecteur de clonage et d'expression :
    
  • I.2.1) pcDNA3/Rv3874 :
    
  • I.2.2) pPICZA (Invitrogen):
    
  • I.3) Les enzymes :
    
  • I.3.1) Les enzymes de restriction :
    
  • I.4.) Les marqueurs de poids moléculaire :
    
  • I.4.1) Marqueurs de poids moléculaire d'ADN :
    
  • I.4.2) Marqueur de poids moléculaire de protéines :
    
  • I.5) Les oligonucléotides:
    
  • I.6) Autres matériels :
    
  • II.1) PCR :
    
  • II.2) Electrophorèse sur gel d'agarose :
    
  • II.3) Purification d'ADN à partir du gel :
    
  • II.4) La digestion :
    
  • II.5) La ligation :
    
  • II.6) Transformation des bactéries :
    
  • II.7) Colonie PCR :
    
  • II.8) Préparation des plasmides :
    
  • II.8.1) Préculture bactérienne :
    
• II.8.2) Extraction de l'ADN plasmidique :
  
  • II.9) Electroporation de la levure Pichia pastoris :
    
  • II.10) Production de la protéine recombinante dans Pichia pastoris :
    
  • II.12) Immunoblot et révélation par ECL : « Enhanced ChemiLuminescence » :
    
  • I.1) Stratégie de Clonage :
    
  • I.2) PCR :
    
  • I.3) Digestion et purification du produit PCR et du plasmide pPICZáA :
    
  • I.4) Ligation et transformation des bactéries compétentes E.coli top 10F'.
    
  • I.5) Carte de restriction du plasmide recombinant :
    
  • I.6) Séquençage automatique :
    
    • II.1) Linéarisation de pPICZáA/Rv3874 :
      
• II.2) Transformation par éléctroporation de la souche KM71H de Pichia pastoris :
  
• II.3) Production de la protéine recombinante CFP10 :
  
• II.4) Identification de la protéine recombinante par immunoblot blot :
  
• ANNEXES