II.8.2) Extraction de l'ADN plasmidique :
Nous avons utilisé le kit Qiagen pour l'extraction de l'ADN
plasmidique. La technique d'extraction se base sur la lyse alcaline des
cellules bactériennes. Le kit miniprep permet d'extraire l'ADN
plasmidique à partir de 5 ml de culture.
Après
extraction, on contrôle les formes et les tailles de l'ADN plasmidique
par électrophorèse sur gel d'agarose ;
On
peut également doser l'ADN par spectrophotométrie à 260
nm, en utilisant la relation : une unité de DO correspond à
une solution d'ADN de concentration égale à 50 ug/ml.
La
pureté de l'ADN est estimée par une lecture de la densité
optique à 280 nm, le rapport DO260/280 doit être compris entre 1,6
et 2.
II.9) Electroporation de la levure Pichia
pastoris :
Une colonie de KM71H (sensible à la zéocine), isolée
sur boîte YPD(Yeast extract Peptone Dextrose Medium), est mise en culture
dans 100 ml de BMGY(Buffered complex medium containing glycerol):
jusqu'à ce que la DO600 atteigne une valeur entre 1.3 et 1.5.
Le
culot cellulaire est lavé avec 100ml d'eau stérile froide
après avoir stoppé la culture dans la glace.
Le
culot est ensuite lavé avec 4 ml de sorbitol 1M, très froid
(0°C) puis resuspendue dans 250 ul de cette solution.
A ce stade on a des cellules compétentes.
Dans
une cuve d'éléctroporation on mélange 80 ul de cellules
compétentes (D.O = 1 ,5) avec 5 à 10 ug du plasmide
recombinant pPICZA/Rv3874 qui a été linéarisé par
Bst X I et purifié.
Après
avoir fixé le voltage à 1500 V et la capacitance sur 25 uF, la
cuve est mise dans un éléctroporateur « BIORAD gene
pulser ». On procède de telle manière à ce que
la durée du choc électrique soit entre 5 et 10 ms.
Après
l'addition du sorbitol 1M et l'incubation des cellules dans l'étuve
à 30°C pendant 2 heures, on étale les cellules sur des
boites YPDS zéocine (150ug/ml) à raison de 250 ul par boite.
Les
boites sont incubées à 30°C pendant 2 à 3 jours, les
colonies qui poussent sont normalement des transformants.
L'éléctroporation
permet d'internaliser le vecteur de clonage propre à Pichia
pastoris, qui va s'intégrer par recombinaison homologue dans le
génome de la levure. Cette recombinaison est dirigée par les
séquences homologues du gène AOX1.
II.10) Production de la protéine recombinante
dans Pichia pastoris :
Le clone choisi pour la production est mis en culture dans 50 ml de BMGY
sous agitation de 250 rmp à 30°C, jusqu'à ce que la DO600
atteigne une valeur comprise entre 2 et 6.
Le
culot cellulaire est ensuite resuspendu dans 5 ml (1/10ème de
volume initiale) de BMMY (Buffred Methanol-complex Medium) à 1% final de
méthanol.
Chaque
24 heures, on ajoute du méthanol à 1% final et on
récupère 100 ul de culture pour suivre la cinétique de la
production à 24, 48 et 72 heures.
II.11) Electrophorèse des protéines sur gel de
polyacrylamide en présence de SDS
(SDS-PAGE :SDS-Polyacrylamid Gel Electroporesis) :
Pour un gel de migration prévoir 15 ml de gel de séparation
et 5 ml de gel de concentration :
a)
Le gel de séparation : 15 %
b/
Le gel de concentration :
-
Monter les plaques sur le support de polymérisation.
-
Couler d'abord 5ml de gel de séparation (jusqu'au premier écran
du support).
Compléter
avec de l'eau pour aplatir la surface du gel. Après
polymérisation du premier gel, éliminer l'eau avec du papier
filtre et couler en haut le gel de concentration. Laisser polymériser
après avoir mis le peigne.
-
Après polymérisation, placer le montage sur le support de
migration et poser l'ensemble dans la cuve vide (sans tampon). Couler ensuite
le tampon de migration.
-
Déposer les échantillons (préalablement
additionnées de 1/3 de volume de tampon d'échantillon 3X et
dénaturer 5' à 100°C). Déposer aussi le marqueur de
taille RainBow (3ul). Faire migrer pendant environ 45' sous un voltage de 120
V.
A
la fin de la migration, les protéines séparées selon leur
poids moléculaire sont soit colorées au bleu de Coomassie soit
transférées sur membrane de nitrocellulose (technique
d'immunoblot).
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