I.2) Vecteur de clonage et d'expression :
I.2.1) pcDNA3/Rv3874 :
Le gène Rv3874 a
été cloné entre les sites Bam H I et Xho I dans le vecteur
pcDNA 3 cette construction qui a servi comme matrice pour amplifier l'ADNc
du gène Rv3874 nous a été aimablement fournie par le Dr.
Helmi MERDASSI.
I.2.2) pPICZA (Invitrogen):
C'est un vecteur navette de clonage et d'expression
dans Pichia pastoris de 3593 pb, qui appartient à la famille
pPICz(fig.1).
Les sites de clonage au niveau de ce vecteur se trouvent entre
la séquence du côté COOH terminal codant pour -factor, en
amont, qui est un peptide signal de saccharomyces cereviseae
permettant la sécrétion de la protéine recombinante dans
le milieu extracellulaire ; et en aval du côté NH2
terminal les séquence codant pour :
- L'épitope myc qui permet une détection facile
des protéines recombinantes soit par ELISA ou par Western Blot.
- Une queue poly-Histidine (6 His) permettant la purification
et la détection rapide des protéines recombinantes
exprimées dans Pichia pastoris
Ce vecteur de clonage présente également :
- Le promoteur AOX1 inductible par le méthanol, ce
promoteur permet l'obtention de taux élevés d'expression de
protéines recombinantes.
- Le gène de résistance à la
zéocine sous le contrôle du promoteur EM7 pour une
sélection dans E.coli et le promoteur TEF1 pour une
sélection dans Pichia pastoris
- une origine de réplication ColE1 dans
E.coli
Le vecteur pPICZA est utilisé pour le clonage du
gène Rv3874 et la transformation de la souche Top10F'. Il a
été également utilisé pour la transformation de
Pichia pastoris (voir figure1).
I.3) Les enzymes :
I.3.1) Les enzymes de restriction :
Ces sont des endonucléases qui coupent de
manière définie et reproductible l'ADN double brin.
Les enzymes utilisées au laboratoire sont des enzymes
de type II qui coupent donc au niveau d'un site de reconnaissance
spécifique.
Au cours de ce travail nous avons utilisé les enzymes
de restriction suivantes :
Tableau 1 : les enzymes de restriction utilisées au
cours de ce travail et leurs propriétés
|
Enzymes
|
Unité/ul
|
Fournisseur
|
T° d'incubation
|
|
BstX I
|
10
|
Amersham
|
45°C
|
|
Eco RI
|
15
|
Amersham
|
37°C
|
|
Xba I
|
15
|
Amersham
|
37°C
|
I.3.2) Les autres enzymes :
Ampli Taq DNA polymérase (Amersham) :
Utilisée lors des réactions de PCR et de
séquençage automatique extraite de Thermus aquaticus.
Cette enzyme possède une mutation dans le domaine
amino-terminal qui élimine l'activité nucléase 5'-3' de
l'Ampli Taq DNA polymrase.
L'enzyme est aussi équipée d'une pyrophosphatase
inorganique thermostable qui élimine les problèmes
associés à la pyrophosphorolyse.
T4 DNA ligase (Amersham) :
Cette enzyme extraite de bactéries infectées par
le phage T4 assure la ligation des brins d'ADN aussi bien à bouts francs
que cohésifs.
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