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Clonage et expression de la protéine CFP10 de Mycobactérium Tuberculosis dans Pichia Pastoris

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par Bilel Masmoudi
INSAT - Ingénieur 2006
  

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VI.5) Le gène Rv3874 et l'antigène CFP10 :

L'analyse du génome a aussi indiqué la présence de gènes codant pour des protéines présentes dans le filtrat de culture de M. tuberculosis et donc sécrétées. Un de ces protéines est CFP10 (culture filtrat protein), une petite protéine codée par le gène Rv3874, c'est un antigène qui est fortement reconnu par les lymphocytes T humains et provoque une production massive d'IFNã cytokine nécessaire à l'activité bactéricide du macrophage. Des études récentes ont montré que cette protéine est impliquée dans le pouvoir pathogène de M. tuberculosis. Lors des études de génomique comparative employant différentes techniques d'hybridation, plusieurs régions de différence (RD1-RD14), codant pour environ 140 protéines, ont été trouvées absentes chez M. bovis BCG, la souche vaccinale, par rapport à la souche virulente M. tuberculosis H37Rv. Ces résultats permettent d'étudier de façon approfondie les différences génétiques potentiellement impliquées dans la virulence de certains membres du complexe M. tuberculosis. Par exemple, la région RD1, qui contient le gène Rv3874, est la seule région absente dans les souches atténuées M. bovis BCG, et M. microti, mais elle est présente chez tous les autres membres du complexe M. tuberculosis. Comme le BCG, la plupart des souches de M. microti sont inoffensives pour l'homme. Ainsi, M. microti a été utilisée comme vaccin dans les années 1960 en Tchécoslovaquie et a fait l'objet de larges essais cliniques au Royaume-Uni. Lors de la réintroduction de la région RD1 par complémentation dans le BCG et dans M. microti, la virulence de ces deux souches vaccinales est partiellement restaurée chez la souris immunodéprimée. En revanche, la réintroduction de cinq autres régions de différence (RD3, RD4, RD5, RD7 et RD9), suspectées d'être impliquées dans la virulence, ne semble pas avoir d'effet sur le pouvoir pathogène de ces deux souches. Comme la région RD1 comprend aussi le gène codant pour l'antigène protéique CFP10, il est maintenant évident que toutes les souches vaccinales employées à grande échelle dans l'histoire de la vaccination contre la tuberculose étaient dépourvues de cet antigène, qui est immunodominant et semble diriger la réponse immunitaire de l'hôte vers la voie Th1, entraînant la production d'IFNã. En effet, l'expression de cet antigène dans le contexte d'un BCG recombinant, ainsi que celle d'autres protéines de la région RD1 impliquées dans la sécrétion duCFP10, augmente l'efficacité du BCG vis-à-vis d'une inoculation avec M. tuberculosis dans différents modèles animaux. Dès lors, les protéines de la région RD1 sont considérées comme des cibles potentiellement très intéressantes dans la prévention (antigène protecteur), le diagnostic (remplaçant le PPD - épreuve à la tuberculine -) et la thérapie (cible de médicament). (3).

I) MATERIEL :

I.1) Souches Bactériennes et levures utilisées :

La souche bactérienne d'Escherichia coli utilisé est :

- Top10F' : F' [ lacIq Tn10 (TetR) ] mcrA Ä(mrr-hsdRMS-mcrBC) 80lacZÄM15 ÄlacX74deoR recA1 araD139 Ä(ara-leu) 7697 galU galK rspL (StrR) endA1 nupG.

- La souche de la levure Pichia pastoris utilisée est KM71H de phénotype : arg4 aoxl : ARG4 et de génotype Muts, Arg+. Elle est fournie par la société Invitrogen.

Cette levure présente plusieurs avantages pour l'expression de protéines recombinantes par rapport aux systèmes classiques :

- Un taux d'expression élevé de protéine de fusion : pouvant aller jusqu'à 12 g/l.

- Un « Scale up » plus facile : le passage à l'expression en fermenteur est plus facile avec Pichia qu'avec les bactéries.

- Pichia pastoris s'adapte plus facilement aux conditions de fermentation que ce soit à des petits volumes (< 1 litre) qu'à des grands volumes (>10 000 litres).

- Un système de sélection simple, varié et efficace.

Pichia est un système d'expression eucaryote d'où l'avantage de réaliser des modifications post-traductionnelles des protéines eucaryotes.

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