III.2) Les vecteurs et cassettes
d'expression :
Pour la production des protéines recombinantes,
les vecteurs ainsi que les cassettes d'expression jouent un rôle
primordial dans l'amélioration de la qualité et la
quantité de la protéine d'intérêt.
En ce qui concerne les cassettes d'expression, elles
consistent en une organisation de différentes séquences
intervenant non seulement dans la régulation et le contrôle de
l'expression des gènes, mais aussi dans le maintien et la
stabilité du vecteur.
Dans le cas de la levure on distingue essentiellement 4
types de vecteurs qui différent par le mécanisme de leur maintien
:
YIP (Yeast Integrating Plasmid) : ce sont des vecteurs
auxquels il manque l'origine de réplication dans la levure, donc qui
doivent se propager comme un élément intégratif dans le
chromosome de la levure et le plus souvent dans une seule copie par
génome.
YRP (Yeast Replicatif Plasmid) : ce sont des vecteurs
qui présentent une séquence de réplication autonome
(ARS), ce sont des plasmides instables et à réplication
autonome.
YCP (Yeast Centromer Plasmid) : ces vecteurs
présentent une origine de réplication et une séquence
centromérique, ce sont des plasmides stables et qui se propagent en un
faible nombre de copies.
YEP (Yeast Episomal Plasmid) : ces vecteurs
présentent un fragment de plasmide de levure de 2um, ils se propagent en
un grand nombre de copies et ils ont une réplication autonome et une
ségrégation irrégulière.
Il est possible de diriger l'intégration du vecteur
ou du moins une partie dans un site spécifique dans le génome de
la levure, où il peut se répliquer d'une façon stable et
se maintient comme une partie du chromosome de l'hôte.
Vu que ces plasmides peuvent s'amplifier et s'isoler
facilement à partir d' E.coli, chacun de ces vecteurs est
désigné comme un vecteur navette qui inclut des séquences
permettant la sélection et le maintien du plasmide dans les deux
systèmes hôtes, des séquences qui permettent la
transcription et la traduction efficace du gène étranger, des
séquences qui permettent une bonne terminaison de la transcription et la
présence d'un promoteur constitutif et régulable. (12).
IV) Le système d'expression Pichia
pastoris :
IV.1) Principaux avantages du système :
Depuis 1980, la société
américaine Phillips Petroleum a créé une filiale, la
société SIBIA (Salk Institut Biotechnology Industrial
Associates), qui se consacre au développement et l'exploitation de
Pichia pastoris.
SIBIA a breveté cette levure, et a produit comme essai,
l'antigène HBs : son expression intracellulaire est
impressionnante. Les taux obtenus sont 5 à 100 fois plus
élevés que S.cerevisiae.
La société a également annoncé
quelle avait obtenue 6 à 10 g de TNF purifié par litre de
culture.
Lorsque les protéines hétérologues sont
secrétées, les taux obtenues sont plus faible mais ils restent
extrêmement intéressants : l'antigène HBs a
été produit à raison de 2 g/l, l'invertase 2,3g/l et un
taux qui dépasse 1g/l pour la sérum albumine humaine.
Plusieurs avantages sont offerts suite à l'utilisation
de pichia pastoris parmi ces avantages on peut citer :
· La facilité de manipulation.
· Taux d'expression important (10 à 100 fois plus
élevé que S.cerevisiea ).
· Pichia pastoris offre un choix d'expression de
la protéine recombinante sous forme intracellulaire ou
secrétée. (5) ; (7).
· Capacité d'effectuer plusieurs modifications
post-traductionnelles : formation de ponts disulfure, phosphorylation,
acylation, avec un repliement correct des protéines. (19).
· Etant méthylotrophiques, Pichia
pastoris possède la faculté d'assimiler le méthanol
comme une seule source de carbone et d'énergie, en effet cette levure
possède une voie d'utilisation de méthanol hautement inductible,
elle est capable de convertir 30 à 40% de son poids en protéines,
ces protéines qui sont synthétisées lorsque la levure
pousse sur le méthanol sont indétectable lorsque la levure pousse
sur le glucose ou le glycérol. (22).
· Les problèmes d'hyperglycosylation
observés chez S.cerevisiea sont beaucoup moins importants pour
Pichia pastoris.
· La stabilité de la cassette d'expression dans le
génome de la levure, sa capacité de sécrétion, les
faibles taux de protéines contaminants dans le milieu de culture et la
rapidité de croissance de la levure sur des milieux non coûteux et
dans les fermenteurs font de Pichia patoris un système de choix
pour l'expression de protéines hétérologues. (8).
Vu ces caractéristiques intéressantes :
certaines protéines (exemple la protéine G) qui n'ont pas
étaient sécrétées d'une manière efficace
chez les bactéries ou chez saccharomyces cerevisiae ou dans les
cellules d'insectes ont était obtenues avec succès dans
Pichia pastoris. (9) ; (19).
| 
