II.3) Purification d'ADN à partir du gel :
Après migration sur gel d'agarose « low
melting » les bandes spécifiques de l'ADN à purifier
sont coupées sous U.V et pesées.
Le
Kit Qiagen permet la purification des fragments d'ADN qui se fait sur une
colonne Tip-20 (colonne de silice chargée positivement) en utilisant les
réactifs du kit.
L'élution
se fait avec 50ul de tris-HCI pH 8, la purification est contrôlée
par électrophorèse sur gel d'agarose.
II.4) La digestion :
Afin de cloner le gène Rv3874, dans le bon sens, dans le vecteur pPICZA
entre les sites choisis EcoR I et Xba I, l'insert et le plasmide sont
digérés par ces enzymes de restriction.
Les
conditions de digestion sont les suivantes :
Tableau
2 : Mélange réactionnel de la digestion par Xba I et EcoR
I
Le tampon 10 X M est choisi parce qu'il permet une activité de 100% pour
les enzymes EcoR I et Xba I.
Le
mélange réactionnel est incubé à une
température de 37°C dans un bain marie pendant six heures.
Les
produits de digestions sont contrôlés sur gel d'agarose, si la
digestion est totale nous procédons à la ligation, après
avoir purifié le produit de digestion.
II.5) La ligation :
La T4 DNA Ligase est une enzyme qui catalyse la formation d'une liaison
phopho-diester entre deux bouts d'ADN, 3'-OH libre et 5'-phosphate. Cette
réaction qui nécessite de l'ATP permet l'insertion du gène
désiré au sein du plasmide digéré et parfois la
recircularisation du plasmide lui-même.
La
réaction de ligation est réalisée à 16°C avec
une incubation de 16 heures du mélange réactionnel suivant :
-L'
ADN plasmidique digéré par les enzymes de restriction choisies et
purifiées.
-
l'insert à cloner est digéré par les mêmes enzymes
de restriction et purifié.
-
Le tampon de la T4 DNA ligase est dilué au 1/10 (final).
-
de la Ligase (10 U/ul) (sachant qu'1UI de T4 DNA ligase permet de liguer 1 ug
d'ADN).
II.6) Transformation des bactéries :
La souche Top 10 F' a été transformée par le produit
de ligation pPICZa/Rv3874 pour l'amplification du plasmide recombinant.
Pour
assurer la transformation des souches bactériennes on doit passer en
premier lieu par la préparation de cellules compétentes.
Plusieurs
méthodes sont disponibles mais nous avons utilisé au cours de ce
travail la méthode de TSS(Transforming and Storage Solution).
Méthode
du TSS.
Une colonie ( Top 10f') isolée est suspendue stérilement
dans respectivement 5 ml de milieu LBLS, et mise en culture pendant une nuit
à 37°C sous agitation à 220 rpm. Un ml de cette culture est
transféré dans un erlen de 500 ml stérile contenant 50 ml
de milieu LBLS.
Les
cellules sont incubées à 37°C sous agitation à 220
rpm jusqu'à ce que DO600 nm atteigne 0,4 à 0.6
unité. La culture est alors mise dans de la glace pendant 30 min pour
stopper la prolifération bactérienne. Les cellules sont par la
suite centrifugées à 1200 g pendant 15 min à
4°C.
Le
culot cellulaire est resuspendu dans 4 ml de solution de TSS froide, contenant
le DMSO, agent fragilisant la membrane cellulaire, puis le mélange est
réparti dans des tubes à raison de 150 ul par tube eppendorf.
A
ce stade on a des cellules compétentes qu'on incube par la suite en
présence de 7 à 15 ng d'ADN plasmidique tout en gardant tout dans
la glace pendant 30 min, puis tout est transféré dans un bain
marie à 42°C pendant 1min afin d'effectuer un choc thermique
permettant l'entrée des plasmides dans les bactéries.
On
ramène de nouveau les tubes dans la glace. On ajoute 350 ul de milieu
LBLS et on incube pendant 45 à 60 min à 37°C.
100
ul du produit de la transformation sont étalés sur milieu LBLS
contenant 1,5 % d'agar + 25 ug/ml zéocine. Les boites de culture sont
incubées pendant une nuit à 37°C.
Les colonies qui poussent sont criblées par colonie PCR
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