V.2) Mode d'intégration du gène
d'intérêt :
Les vecteurs utilisés pour
l'expression des protéines recombinantes sont des YIP
c'est-à-dire qu'ils ne possèdent pas d'origine de
réplication chez la levure et donc ne peuvent se propager que par leur
intégration dans le génome de l'hôte.
L'insertion de la cassette d'expression se fait par
recombinaison homologue entre l'ADN plasmidique et les régions qui lui
sont homologues dans le génome de Pichia pastoris, cette
recombinaison dirigée par le gène AOX1 montre une grande
stabilité surtout lorsque le gène d'intérêt est
présent en plusieurs exemplaires.(9).
Figure2 : Schéma explicatif de
l'insertion de la cassette d'expression dans le génome de pichia
pastoris
V.3) Le nombre de copies de la cassette
d'expression :
Généralement on montre que le nombre
élevé de cassettes d'expression (>10) dans le génome de
la levure se traduit par une augmentation du taux d'expression de la
protéine d'intérêt. Plusieurs exemples montrent que
l'insertion d'une simple cassette d'expression est largement suffisante pour un
optimum de production et l'augmentation du nombre de copies n'à pas
toujours un effet significatif sur la production des protéines
d'intérêt. (9).
V.4) Modifications post traductionnelles chez Pichia
pastoris :
Parce que chaque protéine
présente un cas particulier et parce que les propriétés et
la conformation de la protéine produite doivent être proches de
l'état natif, certains d'entre elles doivent subir des modifications
post traductionnelles pour remplir leur fonction.
Chez Pichia pastoris, la glycosylation des
protéines recombinantes est semblable à celle de
saccharomyces puisqu'elle met en jeu des résidus mannoses
N-liés et O-liés. Cependant, Pichia pastoris
présente un avantage par rapport à
saccharomyces : c'est que l'hyperglycosylation est beaucoup moins
importante. En effet, le nombre de résidus mannose ajouté aux
protéines est de 50 à 150 par chaîne pour
saccharomyces alors qu'il n'est que de 8 à 14 chez
Pichia. (20).
V.5) Les facteurs agissant sur la cinétique de
croissance de Pichia pastoris :
La cinétique de croissance des
organismes microbiens dépend de plusieurs paramètres : la
composition du milieu de culture, le mode d'alimentation (Batch, fed batch,
continu), Les conditions physico-chimiques (pH, Température,
agitation...).
Les conditions optimales pour Pichia pastoris sont
les suivantes :
Température : 30°C
PH: 5
Pression d'oxygène : 50% en fermenteur et un
rapport volume/volume=0,2 en Erlenmeyer.
Il faut signaler aussi que chez Pichia pastoris, la
nature et la concentration de la source de carbone influent directement sur sa
cinétique de croissance, en effet, une haute densité cellulaire
est obtenue sur glycérol, par contre, lorsque le méthanol est
utilisé comme source de carbone, le rendement en biomasse est plus
faible. (9).
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