I.3) Digestion et purification du
produit PCR et du plasmide pPICZáA........39
I.4) Ligation et transformation des
bactéries compétentes E-coli top 10 f'....40
I.5) Colonie
PCR........................................................................41
I.6) Carte de restriction de plasmide
recombinant.................................41
I.7) Séquençage
automatique.........................................................42
II) Transformation et expression du gène Rv3874 dans la
levure Pichia pastoris
KM71H.............................................................................................43
II.1) Linéarisation de
pPICZáA / Rv3874..........................................43
II.2) Transformation par électroporation de
la souche KM71H de Pichia
pastoris..............................................................................................44
II.3) Production de la protéine
recombinante CFP10-myc epitope-6his.........44
II.4) Identification de la protéine
recombinante par western blot................45
D] Conclusions et perspectives
Références bibliographiques
Avant propos
Grâce aux avancées
scientifiques spectaculaires des vingt dernières années en
matière de génie génétique et de biologie
moléculaire, il est aujourd'hui envisageable de modifier le patrimoine
génétique d'un organisme vivant en lui incorporant un fragment
d'ADN provenant d'une espèce différente et de lui faire exprimer
cette information génétique étrangère. Ces
savoir-faire nouveaux de la génétique ont permis d'ouvrir des
voies de recherche et de développement nouvelles aux perspectives
considérables. Il devient possible aujourd'hui, en s'appuyant sur ces
méthodologies, de reprogrammer le matériel
génétique d'un micro-organisme en lui insérant un
gène précis, qui lui permettra de produire une protéine
recombinante précieuse (à usage médical :
interféron, insuline, hormone de croissance... ou industriel :
enzymes...).
Cependant, le processus de conversion de l'information
génétique en protéine biologiquement active se heurte
à plusieurs problèmes aussi bien d'ordre qualitatif que
quantitatif tels que le problème de repliement intracellulaire des
protéines. En effet de nombreuses protéines recombinantes ne sont
pas produites dans leur état natif, et s'agrègent dans un
état biologiquement inactif. Pour cette raison, il est souvent
souhaitable d'intervenir en amont, sur le système d'expression pour
minimiser ces problèmes et donc obtenir une protéine recombinante
la plus proche possible de la protéine native.
La tuberculose est une maladie infectieuse chronique,
c'est l'un des plus grands fléaux de l'humanité avec plus de dix
millions de nouveaux cas et trois millions de décès chaque
année.
Cette situation s'aggrave avec l'émergence de souches
multirésistantes et le SIDA. Ainsi, la génomique, la
protéomique et la transcriptomique ont été rapidement
adaptés pour la recherche des gènes à haut potentiel
diagnostic ou à intérêt vaccinal.
Mycobactérium. tuberculosis l'agent
pathogène de la tuberculose sécrète toute une famille des
protéines dites CFP (culture filtrat protéine) dont la
protéine CFP10.
Dans ce travail, nous nous sommes donc intéressé
au gène Rv3874 qui code pour la protéine CFP10 précocement
sécrétée par M.tuberculosis dans le milieu de
culture ainsi que dans la première phase de l'infection par ce
pathogène. CFP10 est un antigène immunodominant et candidat
potentiel pour le diagnostic de la tuberculose.
Dans le but d'obtenir une protéine sous forme
recombinante nous avons donc procédé au clonage du gène
Rv3874 de M.tuberculosis dans le vecteur pPICZáA destiné
à la transformation de la levure méthylotrophique Pichia
pastoris que nous avons ensuite transformée par
éléctroporation et à la production de cette
protéine sous forme recombinante soluble.
I) les protéines recombinantes :
Une protéine recombinante est le résultat
d'un transfert du gène d'intérêt qui code pour cette
protéine dans une cellule hôte en vue de la produire. L'insuline
fut la première protéine recombinante humaine produite au
début des années 80 par la technologie de l'ADN recombinant.
Cette technologie a bénéficié des avancées
scientifiques de ces deux dernières décennies, en matière
de génie génétique, de biologie moléculaire ainsi
que du développement des techniques de culture des microorganismes
à haute densité cellulaire. Au sens large, un système de
production adapté à la fabrication d'une protéine
recombinante donnée, est un processus biotechnologique qui s'appuie
principalement sur :
· L'emploi d'un vecteur d'expression (en
général un plasmide ou un virus), jouant le rôle de
transporteur génétique du gène d'intérêt
codant pour la protéine recherchée.
· L'utilisation d'une cellule hôte, chargée
d'exécuter les instructions fournies par le gène
d'intérêt qui lui est inséré, dans l'objectif de
synthétiser la protéine recherchée.
· Une phase de production proprement dite permettant de
fabriquer la protéine souhaitée.
· Enfin, sa purification à partir du milieu de
culture.
Au sens restreint, un système de production de
protéines recombinantes est caractérisé par un couple
constitué d'un vecteur d'expression et d'un hôte (cellules ou
organismes entiers tels que des animaux ou des plantes, au quel on a
transféré le ou les gènes codant pour ces
protéines.).
II) Les critères de choix d'un système
d'expression :
Le choix du système d'expression est
principalement guidé par les modifications que la protéine doit
subir pour être biologiquement active. Bien qu'il existe des techniques
permettant le transfert rapide des gènes clonés entre
différents systèmes d'expression, le vecteur
génétique, utilisé pour exprimer le gène
recombinant, doit être adapté à l'hôte choisi. De
même, il est important de connaître les compartiments cellulaires
dans lesquels la protéine d'intérêt se replie ou exerce son
activité biologique naturelle. Selon que cette protéine est
cytoplasmique, membranaire ou extracellulaire, le vecteur devra contenir des
séquences spécifiques permettant l'adressage correct de la
protéine. Pour cela il est nécessaire d'intervenir en amont en
optimisant les conditions d'expression de la protéine. Le choix du
système d'expression constitue l'une des étapes critiques dans le
processus de production des protéines hétérologues.
(2).
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