Annexes 01 : Les méthodes des travailles
classiques
1- Étude macroscopique (l'aspect) des colonies
:
La première étape du diagnostic bactérien et
du bio typage d'une souche est la description macroscopique des colonies
isolées ; parfois cette seule étude permet de connaître le
germe qu'on a en présence car les colonies sont typiques....
Cette description doit mentionner :
· La taille : diamètre des
colonies. Vous pouvez mesurer cette taille à l'aide d'une règle
graduée. On distingue :
? Colonies punctiformes : Colonies à
peine visibles, dont la taille est inférieure au millimètre
? Petites colonies: Colonies dont le
diamètre est compris entre 1 et 2 mm ? Colonies moyennes
: Colonies dont le diamètre est compris entre 1 et 2 mm
? Colonies moyennes: Colonies dont le diamètre est
compris entre 3 et 5 mm ? Grosses colonies : Colonies dont le
diamètre est supérieur à 5 mm
La vue de profil (élévation) (bombée,
plane, ombiliquée, a bords surélevés ou en oeuf au plat)
et avec vue de dessus (bords ou contours) (bords : dentèles, en
étoile, ovoïde, régulière, ondulée,
lobée).
· L'aspect de la surface (lisse, rugueuse,
brillante).
· L'opacité. Les colonies opaques
ne laissent pas passer la lumière contrairement aux translucides.
Certaines sont très transparentes, car ils laissent passer la
lumière.
· La consistance. Elle se juge au moment
du prélèvement. On distingue les colonies crémeuses des
sèches et des muqueuses (gluantes).
· La couleur ou pigmentation. La plupart
des colonies isolées sur gélose ordinaire sont couleur
crème (sans pigment) mais certaines sont blanc porcelaine, jaune,
vert,... (Tekkouk, 1977 et Bourgeois et Leveau ,1980).
Figure N° 33 : aspect macroscopique des
colonies bactériennes (Khadir Abdelmounaim). 2-
L'étude microscopique :
L'observation microscopique permet de faire une étude
morphologique des cellules d'une espèce bactérienne
(Aboulala, 2008). Elle comprend :
? L'état frais :
Cet examen permet d'apprécier la forme et parfois la
mobilité des germes étudiés. Technique :
1. À partir d'une culture en milieu liquide :
Déposer sur une lame propre soit le contenu d'une «
anse de platine » soit « une petite goutte» à l'aide
d'une pipette Pasteur. Recouvrir la goutte d'une lamelle, éviter les
bulles d'air. Et recommencer au besoin.
2. À partir d'une culture sur milieu solide :
Déposer une gouttelette de liquide (milieu liquide ou eau)
sur la lame. Prélever une trace de culture à l'anse de platine et
l'émulsionner dans le liquide.
? Après coloration :
1) Préparation du frottis :
2) Étalement : l'étalement doit
se faire en couche mince, sur une lame dégraissée.
3)
[ANNEXES 01]
Annexes
Séchage : laisser sécher
à l'air.
4) Fixation : passer trois fois rapidement
dans la flamme du bec Bunsen la face de la lame opposée à
l'étalement. Ne pas trop insister sous peine de carboniser le
prélèvement. On peut également fixer en laissant
évaporer quelques gouttes d'alcool éthylique versées
directement sur le prélèvement.
5) A ce stade les germes ne sont plus
considérés comme contaminants. Liquide (Guiraud
.2003).
2.1-Coloration simple :
Coloration au bleu de méthylène
Sur le frottis fixé et refroidi :
- Faire couler la solution de bleu de méthylène
phéniqué jusqu'à ce que toute la lame soit recouverte.
- Laisser agir 1 minute.
- Rincer abondamment la lame avec le jet d'une pissette d'eau
distillée, ou à l'eau du robinet jusqu'à
élimination des colorants en excès.
- Sécher à l'air ou sur une platine chauffante,
ou encore sécher délicatement entre deux feuilles de papier
filtre fin (ou buvard), sans frotter.
- Examiner au microscope, objectif à immersion.
Résultats : les bactéries sont colorées en bleu sombre.
Cette coloration est intéressante pour l'observation rapide des frottis,
mais elle permet seulement l'étude de la morphologie des
bactéries.
Il est donc souvent nécessaire de la compléter
par une coloration de Gram (Guiraud .1998).
2.2-Coloration différentielle : Coloration de Gram
:
C'est une coloration qui permet de mettre en évidence
les propriétés de la paroi bactérienne, et d'utiliser ces
propriétés pour les distinguer et les classifier en deux grands
groupes:
[ANNEXES 01]
Annexes
? Gram+ : qui ont une paroi de peptidoglycanes
épaisse (ex : Bacillus cereus).
? Gram- : qui ont une paroi de
peptidoglycanes fine, mais ont en plus une membrane externe (Khadir
Abdelmounaim).
Protocole :
1. Coloration par le violet de Gentiane ou cristal violet :
laisser agir de 30 secondes à 1 minute. Rincer à l'eau
déminéralisée.
2. Mordançage au Lugol (solution d'iode
iodo-iodurée): étaler le lugol et laisser agir 30 secondes ;
Rincer à l'eau déminéralisée. On peut
réaliser une deuxième fois l'opération identiquement pour
plus de sécurité.
3. Décoloration (rapide) à l'alcool
(+acétone): verser goutte à goutte l'alcool ou un mélange
alcool-acétone sur la lame inclinée obliquement, et surveiller la
décoloration (5 à 10 secondes). Le filet doit être clair
à la fin de la décoloration. Rincer sous un filet d'eau
déminéralisée ;
4. Recoloration à la Safranine ou à la Fuchsine
: laisser agir de 30 secondes à 1 minute. Laver doucement à l'eau
déminéralisée.
5. Sécher la lame sur une platine chauffante à
40°C, 10 à 15 minutes ou à l'air libre.
6. Examen. Observer avec une goutte d'huile à
immersion objectif 100 (X1000) (Guiraud 2012 et Bourgeois et Leveau
,1980).
Figure N° 34: les différentes formes
de cellules bactériennes (Khadir Abdelmounaim).
Test catalase :
Le test est réalisé à partir une culture sur
milieu gélosé (Guiraud ; 2012).
* Principe :
En présence d'oxygène moléculaire,
certaines réactions métaboliques conduisent à la formation
d'eau oxygénée. La catalase est une enzyme qui dégrade
l'eau oxygénée en eau et oxygène.
2 112O2 2112O+ O2
Technique : déposer sur une lame de verre
une ou deux gouttes d'eau oxygénée à 10 volumes.
Prélever à l'aide de l'effilure d'une pipette
pasteur un fragment de colonie et dissocier la culture dans l'eau
oxygénée.
Lecture : la présence d'une catalase se
traduit, en quelques secondes, par la formation de bulles d'oxygène (une
effervescence (dû à un dégagement de dioxygène)
signe la présence
[ANNEXES 01]
Annexes
d'une catalase). Si rien n'est observable, la bactérie
ne possède pas l'enzyme (Guiraud, 1998 et Karen
Reiner,2010).
Figure n° : Résultats positive de
teste catalase.
[ANNEXES 02]
Annexes
| 
