I.2.7.2.Détermination du taux de solides solubles
«TSS ou Brix» (NF V 05-109 ,1970)
A voir la page 45 matériel et méthodes
I.2.7.3.Dosage des sucres totaux (méthode de Dubois,
1956)
A voir la page 45 matériel et méthodes
I.2.7.4.Dosage d'acidité titrable
A voir la page (56-57) matériel et méthodes
I.2.7.5.Détermination de la densité
(Siboukeur, 2008)
Elle nous renseigne sue l'état des produits par la mise en
oeuvre du taux de matière solide et
de la viscosité. Elle donc d'une importance
considérable dans la mesure où elle nous
renseigne sur l'aptitude des micros- organismes vis à vis
de l'état physique du milieu. Elle est
mesurée par lecture direct à l'aide d'un
densimètre ou pynctomètre.
La détermination de la densité est
réalisée par pynctomètre en verre vide. Le calcule se
fait
selon les formule (11) (12)
ñv = M1 - M0 (11)
Avec:
I.2.7.6.Détermination de la viscosité par la
loi de Stokes (Stokes,1981)
Principe
La viscosité est mesurée a l'aide du
viscosimètre a chute de bile (HAAKE).en Pascal par seconde (Pa/s) selon
la formule suivante :
(13)
r2+ (P2-P1 )+g
ç=
9V
D'où :
ç : viscosité.
P2 : la densité de la taille égale
: m/v ; m : masse de la bille et v
:4/3*ð*r3.
P1 : la densité du produit.
g:la gravité.
r : rayon de la bille utilisée.
v : la vitesse de la bille égale L/t ;
L : mesurer la distance entre les deux marques de tubes
Page 62
Chapitre I : Matériels et méthodes
|
Partie 2 : Etude expérimentale
|
|
|
t : le temps en secondes de chute de la
taille a travers le produit a analyser.
? Mode opératoire
Le vinaigre est placé dans le tube du
viscosimètre puis on mesuré a l'aide d'un chronomètre
le temps « t »(en secondes) de passage de la billes
en distance « h »qui sépare les deux repères
A et B du viscosimètre et on a calculé la
viscosité du produit par la formule précédente.
I.2.7.7. Dosage de l'alcool (Audigité et al.,
1984).
Le dosage de l'alcool au cours de la fermentation est
effectué avec un alcoomètre
(gradué 0° à 100°). La méthode
consiste à mesurer le degré alcoolique, à la
température
Ambiante20°C, et lecture directe sur le gradient.
Le suivi de la production de l'alcool au cours de la
fermentation est d'une importance
considérable. Il renseigne sur l'évolution de
l'activité métabolique des micro-organismes.
? Matériels et méthodes
Le dosage de l'alcool est réalisé par la
distillation du vinaigre, l'oxydation et le titrage
? Principe
L'éthanol est oxydé par une quantité
connue et en excès de bichromate de potassium, en
milieu acide, l'excès de bichromate est dosé par
todométrie. Après dilution du milieu, on
ajoute un excès d'iodure, de manière à
réduire le bichromate du milieu et l'iode formé est dose
par le thiosulfate.
Le degré alcoolique peut se mesurer au moyen d'un
ébulliomètre on d'un alcoomètre indice de
0 à 10 et de 10 à 20. Il peut aussi être
détermine théoriquement : 1.7 g de sucre (saccharose)
fomente forme I ml ou 1 d'alcool pur.
1°Alcoolique = g d'alcool pure dans 100 ml de
solution.
? Mode opératoire
? Distillation de l'alcool
Dans un bécher mélanger:
-30 ml du vinaigre.
-200 ml d'eau distillée.
? Ajuster le pH du mélange par une solution de soude
à 0,1 N jusqu'à PH=8.
? Dans un ballon de distillation, verser le mélange
obtenu après l'ajustement.
? Introduire 5 billes en verre.
? Distiller doucement en évitant tout entrainement,
recueillir environ 8ml de distillat
dans 10 ml d'eau distillée.
? Le distillat récupéré est mis dans une
fiole jaugée de 100 ml.
Page 63
Chapitre I : Matériels et méthodes
|
Partie 2 : Etude expérimentale
|
|
|
? Compléter le volume avec de l'eau distillée
jusqu'au trait de jauge.
2-Méthode de dosage de l'alcool
V' Dans une fiole d'Erlen Meyer de 150 ml, introduire
:
V' 20 ml de distillat.
V' 20 ml de solution de nitro-chromique à 0,05 N.
Boucher et attendre 30 min (pour que
l'oxydation de l'alcool soit complète).
V' Ajoute 10 ml de solution de lugole concentré
à100 g/1 après avoir préalablement
dilué le milieu par 40 ml environ d'eau
distillée.
V' Attendre 1 minute, puis doser l'iode forme par une
solution thiosulfate à 0.05 N de
titre connu.
> Témoin
Opérer comme pour l'essai, en remplaçant les 20 ml
de distillat par 20ml d'eau distillée.
> Expression des résultats
Cette expression a été démontrée en
se basant sur la méthode décrit par Audigité
et
collaborateurs (1984)
E1
Taux d'alcool (g/l) =TS2O3-2
(V2×E2 - ????)) ×
(46/4) × (1/E») × (E'/E) (14)
Ou :
V1 : Volume de thiosulfate utilisé pour
doser l'échantillon.
V2 : Volume de thiosulfate utilisé pour
l'essai à blanc. E : Volume de l'échantillon.
E1 : Volume de nitro- chromique pour l'essai.
E2 : Volume de nitro- chromique pour le
témoin.
E' : Volume de la solution dilué de
l'échantillon
E» : 20 ml de distillat que l'on soumit
à l'oxydation par nitrochromique.
Etude statistiques :
Nous avons faires des études statistiques (calcule la
moyenne et l'écartype) pour tous nos
résultats trouvable et nous avons utilisés teste
ANOVA pour les analyses statistiques de
densité optique (DO) dosage de sucres (Annexes 04).
1.2.8. Analyses microbiologiques
1.2.8.1. Technique d'isolements des bactéries
acétiques
La technique d'isolement consiste à prélever 0.1 ml
de solution mère et 0.1 ml des dilutions
(10-1 à 10-3) à l'aide d'une
pipette Pasteur stérile pour l'étalement.
Page 64
Chapitre I : Matériels et méthodes
|
Partie 2 : Etude expérimentale
|
|
|
Le milieu de culture de base pour les bactéries
acétique est un milieu liquide glucosé contient des CaCO3
(bouillon pour bactérie acétique) ou le même milieu
gélosé (gélose pour bactérie acétique) .Pour
un isolement sélectif, il est préférable d'utiliser milieu
à l'éthanol du type de ceux décrits pour
différencier les Acetobacter des Gluconobacter et qui
permettent à la fois un isolement et une différenciation: milieu
gélose de Carr ou milieu gélose de Frateur. Ce milieu peut
être additionné éventuellement d'actidione si le produit
étudié contient beaucoup de levures. Le milieu DSM permet
également d'isoler et de différencier les bactéries
acétiques : il contient du sorbitol et du mannitol, du
désoxycholate et de la cycloheximide comme agent sélectif et du
lactate comme agent de différentiateur (avec BCP). Les Acetobacter
font au pourpre (lactate+) contrairement aux Gluconobacter qui
restent jaune (lactate -) (Guiraud, 1998).
? Prélèvement de colonies
isolées
On prélevant les colonies apparaissant
morphologiquement différentes. Sur le milieu d'isolement (milieu
Frateur), et par étalement régulier, les
prélèvements s'effectuent, prenant tous les colonies
isolées, et les colonies apparaissant morphologiquement
différents sur les autres. Il nécessaire de prélever au
hasard plusieurs colonies d'un même type pour vérifier
l'homogénéité (Guiraud, 2012 et NF.ISO
7218).
? Purification des souches (repiquages
successifs)
La méthode courante utilise des tubes de milieu solide
inclinés ou en culot .Une fois ensemencés, les tubes sont
placés à étuve pour que la croissance débute puis,
avant qu'elle ne soit trop abondante, les tubes sont placés dans une
armoire réfrigérée à 4°C. La vitalité
de la souche se maintient pendant des durées variables, selon la
température et l'espèce microbienne. Au bout de ce délai,
un nouveau repiquage est réalisé.
Les bactéries demandent un repiquage plus
fréquent. Il conseillé de conserver dans ce cas (souches
sélectionnées ou marquées génétiquement) les
repiquages antérieurs et d'effectuer le nouvel ensemencement à
partir du tubes le plus ancien (Guiraud, 2012).
? Conservation
Plusieurs méthodes sont utilisables en fonction de la
souche et du but recherché. La technique courante de conservation des
souches est celle des repiquages successifs, mais elle est limitée dans
le temps. En effet, certaines souches accumulent des déches toxiques ou
modifient le pH : il est nécessaire de les repiquer très vite
après la fin de la croissance. Pour augmenter la durée de
conserver des cultures importantes, il est nécessaire de recourir
à la dessiccation, à la congélation ou à la
lyophilisation (Bougnou, 1988).
? Congélation
Page 65
Chapitre I : Matériels et méthodes
|
Partie 2 : Etude expérimentale
|
|
|
Elle permet la conservation d'une quantité importante
de germes. Les cultures sont centrifugées stérilement et mises en
suspension dans un milieu à 10 % de glycérol .Elles sont
conservées à -25°C ou mieux à -80°C, la survie
peut attendre plusieurs années (Vicent, 1970).
1.2.8.2. Identification des bactéries
acétiques
L'identification phénotypique utilise un faible nombre
de caractères considérés comme importants tels que la
morphologie, la mise en évidence d'un caractère biochimique
(enzymes), sérologique (anticorps) ect. Les identifications
bactériennes par les caractères biochimiques et
sérologiques sont les plus utilisés en routine (Aboulal,
2008)
> Étude macroscopique (l'aspect) des
colonies
La première étape du diagnostic bactérien
et du biotypage d'une souche est la description macroscopique des colonies
isolées, parfois cette seule étude permet de connaître le
germe qu'on a en présence car les colonies sont typiques....
(Tekkouk, 1977 et Bourgeois et Leveau ,1980).
> Etude microscopique
L'observation microscopique permet de faire une étude
morphologique des cellules d'une espèce bactérienne. Elle
comprend :
> L'état frais
Cet examen permet d'apprécier la forme et parfois la
mobilité des germes étudiés (Annexes 01).
> Coloration simple
Coloration au bleu de méthylène (Annexes 01).
> Coloration de Gram
C'est une coloration qui permet de mettre en évidence les
propriétés de la paroi
bactérienne, et d'utiliser ces propriétés
pour les distinguer et les classifier en deux grands
groupes: Gram + et Gram - (Bourgeois et Leveau ,1980)
(Annexes 01).
> Identification biochimique
Les bactéries acétiques sont
représentées par les genres Acetobacter qui peut oxyder
l'acide acétique et l'acide lactique en CO2 et H2O (pouvoir sur oxydant)
et Gluconobacter qui ne le peut pas.
Une classification des souches fréquemment
utilisées est ancienne classification de Frateur. Cet auteur classe les
souches des bactéries acétiques en quatre groupes:
o Le groupe suboxydans qui correspond au genre Gluconobacter
(ou Acetomonas)
contenant selon Frateur l'espèce G. oxydans avec
quatre variétés.
Page 66
Chapitre I : Matériels et méthodes
|
Partie 2 : Etude expérimentale
|
|
|
o Le groupe mesoxydans qui correspond à la
majorité des espèces d'Acetobacter
(considérées par Frateur comme des sous-espèces
d'A. acetie).
o Les groupes oxydant et peroxydans qui correspond à
l'espèce A. pasteurianus (et selon Frateur, respectivement
à A. pasteurianus avec cinq sous-espèce et A.
peroxydans) (Guiraud ; 2012).
La classification des souches en groupes, espèce et
variétés est basée sur les testes suivant: ?
Pouvoir suroxydant
Le pouvoir suroxydant est mise en évidence sur le
milieu Carr : virage au jaune du vert de bromocrésol pour Gluconobacter
et virage puis réversion au bleu pour Acétobacter .Il doit
être vérifié par culture sur le milieu gélosé
au lactate de calcium. Ce milieu est prépare en boite pétri et
ensemencé par touches. La production de CO2 et donc pouvoir suroxydant
se traduisent par une précipitation de carbonate de calcium autour des
colonies après 48 heures d'incubation à 28-30°C (zone claire
pour Gluconobacter et zone claire et précipitation marginale pour
Acétobacter) (Guiraud ; 1998).
? Catalase :
Le test est réalisé à partir une culture sur
milieu gélosé (Karen Reiner, 2010).
Principe : En présence
d'oxygène moléculaire, certaines réactions
métaboliques conduisent à la formation d'eau
oxygénée. La catalase est une enzyme qui dégrade l'eau
oxygénée en eau et oxygène.
? Pouvoir cétogène
Certaines bactéries acétiques peuvent
transformer le glycérol en dihydroxy acétone, qui peut être
mise en évidence par la liqueur de Fehling. Un milieu gélose au
glycérol est coulé en boite de pétri et ensemencé
par touches. Après 48 h d'incubation à 28-30 °C, la surface
du milieu est recouverte de liqueur de Fehling. Un halo d'oxyde de cuivre rouge
se développe autour des colonies à pouvoir
cétogène. Ce pouvoir peut être testé sur d'autre
alcool en remplaçant le glycérol par les produits à tester
(Guiraud ; 1998).
? Culture en présence d'ammonium comme seule
source d'azote et de 3% d'éthanol.
La culture est réalisée en utilisant le milieu
liquide de Hoyer-Frateur. L'inoculation est réalisée avec une
faible quantité de bactéries (une a trois gouttes de suspension
dans l'eau physiologique, réalisée a partir d'une culture sur
milieu solide). Le milieu est incubé à une température
comprise entre 28 et 30 °C pendant une période de 2à 14j. Le
développement est comparé à celui d'un milieu
témoin sans ammonium (Guiraud ; 2003).
? Présence d'un pigment
Page 67
Chapitre I : Matériels et méthodes
|
Partie 2 : Etude expérimentale
|
|
|
Sur le milieu d'isolement certaines souches de
bactéries acétiques possèdent un pigment rose ou brun
(Guiraud ; 2012 et Mariama. c et. al ; 2021).
? Formation d'acide gluconique à partir du
glucose.
Elle est mise en évidence sur le milieu de culture de
base pour bactéries acétiques (gélose pour
bactéries acétiques). Ce milieu coulé en boite de
pétri contient du glucose et du carbonate de calcium. La production
d'acide se traduit après 48 heures d'incubation à une
température comprise entre 28 et 30°C par clarification du milieu
autour des colonies (Guiraud ; 2012).
? Formation d'acide cétogluconique
La formation d'acide cétogluconique à partir de
gluconate est réalisée en utilisant le milieu de Haynes que l'on
incube à une température de 30°C pendant 48h .La
révélation se fait à l'aide du réactif
Bénédict avec 10 min de chauffage au bain marie à
100°C :il apparait un précipité rouge orangé. La
technique utilisée pour mettre en évidence le pouvoir
cétogène est utilisable en remplaçant le glycérol
par du gluconate. La formation d'acide cétogluconique peut aussi
être recherchée à partir d'un milieu glucosé
(Guiraud ; 2003).
? Production de cellulose
Elle est mise en évidence sur le bouillon pour
bactéries acétiques. La pellicule formée à la
surface du milieu prélevée et placée dans une capsule ou
sur une lame et recouverte de réactif (lugol) puis d'acide sulfurique
à 60%.Le développement d'une couleur bleue traduit la production
de cellulose (Mariama . C et. al ; 2021). Le
développement des fibres d'une couleur bleue signifier une production de
cellulose (Gibbs et Shapton ,1968)
? Etude de la tolérance des bactéries
acétiques aux températures élève
La thermo- tolérance des souches isolées a
été réalisé dans des milieux liquides de Frateur
(50 ml), ensemencé et incubé aux différentes
températures ; 30°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50°C,
55°C, 60°C. Toutes les cultures sont comparées avec une
culture blanc (50 ml). Les flacons ont été inoculés avec
des colonies jeunes de 48 h d'incubation à 30°C puis incubé
simultanément séparément à des températures
différentes. La qualité totale de biomasse produit a
été déterminée en mesurant l'absorbance de la
culture sur un spectrophotomètre à 600 nm (DO mesuré par
spectrophotomètre) pour tous les échantillons (Mounir et
al. 2016).
? Etude la mobilité et l'utilisation de
mannitol (essai propre lui) :
Ensemencer avec pipette Pasteur, par piqure centrale, jusqu'au
fond du tube de gélose. Incuber à 30°C pendants 48 h ; la
fermentation du mannitol virage de la couleur au jaune du milieu .Les
bactéries mobiles envahissent tout le milieu à partir de la
piqure centrale.
Page 68
|
Partie 02 : ETUDE EXPERIMENTALLE]
|
Chapitre II : Résultats et discussions
|
|
| 
