II.7 Test microbiologique
L'étude qualitative et quantitative de
l'activité antimicrobienne et antifongique de notre huile essentielle du
thymus vulgaris et la pâte antifongique préparée a
été effectuée au
niveau du laboratoire du département microbiologique du
Centre Algérien du
Contrôle de la Qualité et de
l'Emballage (CACQE).
L'évaluation de cette étude a été
faite sur des bactéries (Escherichia coli et
Staphylococcus aureus) choisies à l'origine de
plusieurs infections (urinaire, intestinales, respiratoire,...etc.) et un
champignon (Candida albicans) choisi pour sa
capacité de contaminer les denrées alimentaires et sa
pathogénicité.
Les souches microbiennes ont été fournies par la
collection des laboratoires microbiologique de l'université de
Constantine.
Le pouvoir antimicrobien est obtenu par la mesure des
diamètres des zones d'inhibition (mm) dont l'échelle d'estimation
de l'activité antimicrobienne est donnée par Mutai et
al.2009. Les diamètres des zones d'inhibition (D) de la
croissance microbienne ont été classés en cinq (05)
classes :
Tableau II.8: Échelle d'estimation de
l'activité antimicrobienne
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Inhibition
|
Diamètres d'inhibition (D) en mm
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Très forte
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D >_ 30 mm
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Forte
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21mm < D < 29mm
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Modérée
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16mm < D < 20mm
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Légère
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11mm < D < 16mm
|
|
Non inhibitrice
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D < 10mm
|
II.7.1 Matériels utilisés
Souches microbiennes : le test microbiologique
est effectué sur les bactéries et le champignon indiqués
dans le tableau si dessus :
Chapitre II Méthodes et Matériels
Tableau II.9: souches microbiennes
testées
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Pour les bactéries
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Gram négatif
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Escherichia coli
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|
Gram positive
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Staphylococcus aureus
|
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Pour les champignons
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Non filamenteux
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Candida albicans
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Milieu de culture :
- Pour les bactéries : Le milieu
Muller-Hinton (M-H) (Figure II.18) - Pour les levures :
Saburraux (SAB) (Figure II.19)
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Figure II.18: Le milieu Muller-Hinton
Figure II.19 : Le milieu Saburraux
Produits et matériels utilisés
:
- L'huile essetielle du thymus vulgaris
(Figure II.20.1)
- Un etaleur (Figure II.20.2)
- Le bec bunsen (Figure II.20.3)
- Les boite de pétri (Figure
II.20.4)
- Papier filtre (la non disponibilité des disques)
(Figure II.20.5)
- Une pince (Figure II.20.6)
- Une anse en platine (Figure II.20.7)
- Tween 80 (Figure II.20.8)
- Alcool chirurgical (Figure II.20.9)
- Éprouvette de 50 ml et 25 ml.
Chapitre II Méthodes et Matériels
1 2 3
4 5 6
7 8 9
Page 48
Figure II.20 : Produits et matériels utilisés pour
l'étude microbiologie II.7.2 Évaluation qualitative de
l'activité antimicrobienne
L'aromatogramme a été réalisé par la
méthode de diffusion en milieu gélosé en
utilisant des disques en papier filtre stérile. Nous avons
utilisé cette technique pour évaluer l'activité
inhibitrice de l'HE du thymus vulgaris et la pâte antifongique
préparée.
Protocole expérimental :
Chapitre II Méthodes et Matériels
Page 49
L'évaluation qualitative de l'activité
antimicrobienne de nos produits, consiste à estimer l'inhibition de la
croissance des microorganismes (bactéries : Escherichia
coli,
Staphylococcus aureus et Champignons : Candida
albicans) en contact de différents produits, et ceci par la
méthode de diffusion sur une plaque de gélose (diffusion sur
milieu gélosé) en utilisant en papier filtre préalablement
stériles de 6 mm de diamètre. En ce qui concerne les formes
semi-solide (pâte préparée) et l'EH, un volume de 0,1
mm3 est déposé au centre de chaque boite à
l'aide d'une seringue stérile.
Préparation de l'inoculum :
La méthode de préparation de l'inoculum consiste
à préparer une suspension en
solution de tween 80, à partir d'une culture de 18-24h
pour les bactéries et de 48h pour le champignon sur le milieu
gélosé [28].
Diffusion sur milieu gélosé :
La méthode de diffusion sur le milieu
gélosé a été réalisée sur le milieu
Muller-Hinton (M-H), pour les bactéries et le Saburraux (SAB), pour le
champignon.
On fait fondre les deux milieux dans un bain marie à
100°C, puis en verse simultanément et aseptiquement une
première couche de chaque milieu dans une boite de pétri à
raison de 12,5 ml par boite avec 2 répétitions par souche.
Après refroidissement à température ambiante, on ensemence
200 ul de suspension de chaque souche par la méthode du râteau et
on laisse solidifier sur la paillasse.
À l'aide d'une pince stérile, on
prélève un disque préalablement stérile de 6 mm de
diamètre, et on l'imbibe d'huile essentielle pur et de disque vide, on
dépose le disque sur la surface gélosée sèche des
boites de Pétri. En ce qui concerne la pâte formulées un
volume de 3 gouttes est déposé sur des disques
préalablement stériles de 6 mm de diamètre au centre de
chaque boite. Puis nous laissons les boites durant 20 minutes à
température ambiante pour permettre la diffusion de
l'échantillon. Elles sont ensuite mises à l'étuve à
37°C pendant 24heures pour les bactéries et à 25°C
pendant 48heures pour le champignon [28].
Le pourcentage d'inhibition de la croissance
bactérienne et fongique est calculé par la formule suivante :
Chapitre II Méthodes et Matériels
Page 50
% Inhibitrice = Dtest/ * 100
Dcontrol
D test : diamètre de la zone
d'inhibition. D control : diamètre de boite de
pétri.
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