0-
00
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ISTMT-IPT 2012-2013
La culture en masse des cellules BHK21 a permis de produire l'HA
rubéolique. Chaque passage cellulaire nécessite un temps
d'incubation de 48h.
Les différents passages de la culture cellulaire et la
production d'HA sont décrites comme suit:
1 flasque 25 cm 2 1 flasques 75 cm2 2
flasques 150cm2
4 flasques 225cm2 4 bouteilles Roller Inoculation
virale
Production d'HA
Pour le titrage de l'Ag, l'agglutination des GR par l'HA est
révélée par la présence d'une voile tapissant au
fond de la cupule (agglutinats visibles à l'oeil nu).
Tableau 1: Résultats de titrage de
l'HA
Cupules
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
9
|
10
|
Dilutions
|
1/4
|
1/8
|
1/16
|
1/32
|
1/64
|
1/128
|
1/256
|
1/512
|
1/1024
|
Témoin négatif
|
Réactifs
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
(ul):
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
-Tacetal
|
75
|
25
|
|
25
|
25
|
25
|
25
|
25
|
25
|
25
|
|
25
|
-Antigène
|
25
|
---
|
|
---
|
|
---
|
|
---
|
---
|
---
|
---
|
---
|
|
---
|
-Dilution
|
|
25
|
|
25
|
|
25
|
|
25
|
25
|
25
|
25
|
25
|
|
-Globules rouges
|
25
|
25
|
25
|
25
|
25
|
25
|
25
|
25
|
25
|
25
|
|
Résultats
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
? Le titre de l'hémagglutinine rubéolique est
compris entre 512 et 1024 unité hémagglutinante (UHA).
·
ISTMT-IPT 2012-2013
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Ce test est fait 2 fois, avec toujours les même
résultats.
· Ce titre est considéré,
élevé.
Dans le test ELISA indirect IgG 6 sérums ont
été utilisés pour contrôler l'efficacité et
la spécificité du lot d'HA produit par la technique de culture
cellulaire :
· 2 sérums négatifs
· 2 sérums moyennement positifs de titre 13 et 10
UI/ml
· 2 sérums fortement positifs de titre 237 et 228
UI/ml
Ces sérums vont nous servir aussi pour connaitre dans le
stade de préparation du Kit ELISA et la dilution adéquate d'HA
à utiliser pour l'étape de la sensibilisation de la plaque
ELISA.
Les résultats des différentes combinaisons
testées sont présentés dans les tableaux suivants:
Tableau 2: Test numéro 1
· Dilution de l'HA = 1/50
· Dilution du sérum = 1/50
· Dilution du Conjugué = 1/10000
· Substrat OPD = 0,5 mg/ml
Référence de sérum
|
Titre connu: UI/ml
|
Densité optique (DO)
492/620 nm
|
Blanc
|
Blanc
|
0,052
|
Blanc
|
Blanc
|
0,066
|
Sérums négatifs
|
587/2013
|
négatif
|
0,225
|
588/2013
|
négatif
|
0,239
|
Sérums moyennement positifs
|
567/2013
|
13 UI/ml
|
0,779
|
436/2013
|
10 UI/ml
|
0,842
|
Sérums fortement positifs
|
623/2013
|
237 UI/ml
|
3,428
|
650/2013
|
228 UI/ml
|
2,952
|
|
ISTMT-IPT 2012-2013
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Ces résultats nous permettent de déduire
l'absence du bruit de fond puisque le DO du Blanc est de l'ordre de 0,06.
· Dans les cupules des sérums moyennement
positifs et fortement positifs il y a apparition d'une coloration
orangée traduite par une absorbance de l'ordre de 0,779 et 0,842 (soit
un DO > 0,5; 0,5 est le seuil de positivité de notre test ELISA), en
effet dans les cupules des sérums négatifs il n'y a pas de
coloration et le DO des deux sérums négatifs est inférieur
à 0,5.
Tableau 3: Test numéro 2
· Dilution de l'HA = 1/50
· Dilution du sérum = 1/100
· Dilution du Conjugué = 1/10000
· Substrat OPD = 0,5 mg/ml
Référence de sérum
|
Titre connu: UI/ml
|
Densité optique (DO)
492/620 nm
|
Blanc
|
Blanc
|
0,069
|
Blanc
|
Blanc
|
0,057
|
Sérums négatifs
|
587/2013
|
négatif
|
0,220
|
588/2013
|
négatif
|
0,217
|
Sérums moyennement positifs
|
567/2013
|
13 UI/ml
|
0,715
|
436/2013
|
10 UI/ml
|
0,601
|
Sérums fortement positifs
|
623/2013
|
237 UI/ml
|
2,328
|
650/2013
|
228 UI/ml
|
2,265
|
|
Comparé au premier essai seulement la dilution des
sérums a changé de 1/50 à 1/100. Ceci confirme l'absence
de bruit de fond.
· Dans les cupules des sérums moyennement
positifs et fortement positifs il y a apparition de coloration orangée,
de même pour les sérums négatifs la DO est toujours
inferieure a 0,5.
ISTMT-IPT 2012-2013
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? Pour les sérums moyennement positifs et fortement
positifs la DO a relativement diminué par rapport a une dilution de
sérum de 1/50.
Tableau 4: Test numéro 3
? Dilution de l'HA = 1/100
? Dilution du sérum = 1/100
? Dilution du Conjugué = 1/10000
? Substrat OPD = 0,5 mg/ml
Référence du sérum
|
Titre connu: UI/ml
|
Densité optique (DO)
492/620 nm
|
Blanc
|
Blanc
|
0,021
|
Blanc
|
Blanc
|
0,025
|
Sérums négatifs
|
587/2013
|
négatif
|
0,018
|
588/2013
|
négatif
|
0,020
|
Sérums moyennement positifs
|
567/2013
|
13 UI/ml
|
0,102
|
436/2013
|
10 UI/ml
|
0,099
|
Sérums fortement positifs
|
623/2013
|
237 UI/ml
|
0,130
|
650/2013
|
228 UI/ml
|
0,128
|
|
Dans le 3éme test, le passage d'une
dilution à la fois d'HA et des sérums de 1/50 à 1/100
entraine une baisse importante de l'absorbance surtout pour les sérums
positifs et en particulier les sérums moyennement positifs dont le DO
est devenu inferieur au seuil de positivité.
ISTMT-IPT 2012-2013
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Tableau 5: Test numéro 4
? Dilution de l'HA = 1/100
? Dilution du sérum = 1/50
? Dilution du Conjugué = 1/10000
? Substrat OPD = 0,5 mg/ml
Référence du sérum
|
Titre connu: UI/ml
|
Densité optique (DO)
492/620 nm
|
Blanc
|
Blanc
|
0,030
|
Blanc
|
Blanc
|
0,027
|
Sérums négatifs
|
587/2013
|
négatif
|
0,111
|
588/2013
|
négatif
|
0,115
|
Sérums moyennement positifs
|
567/2013
|
13 UI/ml
|
0,609
|
436/2013
|
10 UI/ml
|
0,592
|
Sérums fortement positifs
|
623/2013
|
237 UI/ml
|
1,824
|
650/2013
|
228 UI/ml
|
1,997
|
|
Dans le 4ème test nous avons essayé
de garder une dilution d'HA à 1/100 et de prendre les sérums
à 1/50. Ainsi nous avons obtenu des résultats concordants qui
montrent l'absence de bruit de fond. La DO des sérums négatifs
est inferieure à 0,5 (seuil de positivité) et pour les
sérums moyennement positifs et fortement positifs le signal obtenu est
relatif au titre de chaque sérum.
En tenant compte des résultats obtenus avec les 4
essais réalisés nous montrons que dans les conditions des essais
1, 2 et 4 le signal obtenu pour les différents sérums y compris
le Blanc est concordant avec les titres préétablis avec le Kit de
commerce (Kit SIEMENS Enzygnost ELISA IgG) et aussi dans les
conditions préétablies et standardisées pour notre Kit
ELISA IgG Pasteur, développé antérieurement dans notre
laboratoire.
Pour le lot d'HA que nous avons produit et pour des raisons
de rentabilité économique, nous choisissons les conditions de
l'essai numéro 4 qui fixe une dilution d'HA à 1/100.
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Cette dilution sera respectée pour l'étape de
sensibilisation des plaques dans le procédé de préparation
du Kit ELISA IgG Pasteur.
cl~5ios~
G~~ et
peo-09ecti--4re
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