ISTMT-IPT 2012-2013
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VI. Validation du procédé de production
de l'HA rubéolique par le test ELISA indirect type IgG
VI.1 Matériel biologique
? Sérums humains
Des sérums (titrés) IgG négatifs,
fortement positifs et moyennement positifs des malades sont utilisés
pour la validation de l'HA rubéolique déjà
préparée.
Ces sérums qui ont été fournis par le
service de Virologie Clinique de L'institut Pasteur de Tunis sont titrés
et conservés à -20°C.
? L'HA rubéolique (Ag)
L'HA rubéolique du lot (1/2013) est utilisé
dans le test ELISA. Le rôle de l'HA est la sensibilisation de la plaque
ELISA.
VI.2. Principe et étapes du test ELISA
VI.2.1. Principe
Le test ELISA indirect IgG pour la détection des
anticorps anti rubéoliques de type IgG est une technique
immuno-enzymatique. Ce test permet la visualisation du complexe immun (Ac-Ag)
grâce à une réaction colorée produite par le
Substrat chromogène Ortho-Phénylène-Diamine(OPD)
préalablement fixé sur le Conjugué anti IgG marqué
par la peroxydase.
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Substrat
chromogène OPD
Conjugué anti IgG humain marqué à la
peroxydase
IgG anti rubéolique
Hémagglutinine rubéolique
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Principe du test ELISA indirect
VI.2.2. Réalisation du test ELISA indirect type
IgG
Les étapes du test ELISA indirect sont
résumées comme suit:
? Sensibilité de la plaque (coating de
l'Ag)
L'étape de sensibilisation consiste à mettre dans
chaque cupule de la plaque 100 ul d'HA rubéolique (lot 1/2013)
dilué au 1/50ème et1/100ème dans le
Tampon Carbonate/Bicarbonate (0,1M, pH=9,6) (annexe 5).
Cette étape nécessite un temps d'incubation d'une
heure à 37°C ou une nuit à +4°C.
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? Lavage
Après l'étape de sensibilité trois
lavages par le Tampon PBS-Tween (annexe 5) ont
été effectués pour éliminer l'Ag non
fixé.
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Figure 26: Lavage par le Tampon PBS Tween de la
plaque ELISA
? Saturation de la plaque
200 ul de Tampon de saturation PBS-Tween-Gélatine
5% (annexe 5) ont été mises dans chaque cupule de la
plaque ELISA une heure à 37°C pour occuper les sites qui sont
restés vides après l'étape de la sensibilisation.
Cette étape est importante pour éviter les
résultats faux positifs.
? Lavage
Trois lavages successifs par le Tampon PBS-Tween
ont été effectués une deuxième fois pour
éliminer les particules non fixés.
? Incubation du sérum
Les sérums à tester ont été
dilués au 1/50éme et au 1/100éme
dans le Tampon PBS-Tween-Gélatine 5% et repartis
à raison de 100 ul dans chaque cupule de la plaque d'ELISA pour une
durée d'incubation d'une heure a 37°C.
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Figure 27: Incubation du sérum des
malades
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? Lavage
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Cette étape comporte six lavages successifs par le
Tampon PBS-Tween pour éliminer les Ac non fixés
à l'Ag rubéolique.
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? Incubation du Conjugué
Le Conjugué anti IgG humain couplé
à l'enzyme peroxydase (annexe 5) a été
dilué à 1/10000 dans le Tampon PBS-Tween-Gélatine
5% et repartis à raison de 100 ul dans chaque cupule pour une
durée d'incubation d'une heure à 37°C.
? Lavage
Chaque cupule de la plaque est lavée six fois par le
Tampon PBS-Tween pour éliminer le
Conjugué anti IgG humain non fixé.
? Incubation du Substrat chromogène OPD
(Orto-Phénylène Diamine)
(annexe 5)
Le Substrat chromogène OPD est mis à raison de
100 ul par cupule pour une durée d'incubation de 30 min à
température ambiante à l'obscurité pour le bon
déroulement de la réaction de la dégradation du Substrat
et l'apparition de la couleur orangée (il faut recouvrir la plaque ELISA
par du papier aluminium).
? Arrêt de la réaction
Après les 30 min d'incubation la réaction
enzymatique doit être arrêtée par l'ajout de 50 ul
d'acide sulfurique H2SO4 4N (annexe5) dans chaque
cupule.
? Lecture de la plaque par
spectrophotomètre
La lecture de la plaque ELISA se fait grâce au
spectrophotomètre lecteur de plaque ELISA à une longueur d'onde
comprise entre 492 et 620 nm.
? Le test ELISA indirect est utilisé pour la
validation de l'HA rubéolique produite. C'est un test de routine qui se
base sur la révélation des anticorps IgG dans les sérums
grâce à l'HA préparé au Laboratoire
d'Immunotechnologie et Réactifs Biologiques (LIRB).
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