Memoire Online - Validation de procédé de production d'antigène viral sur culture cellulaire bhk21

Streptomycine .2,5g
Filtration avec 100 ml d'eau distillée Utilisation de 2 ml dans 1L de milieu

Les composants du milieu de conservation sont mis dans un tube de 50ml comme suit:

L'Albumine bovine et le saccharose sont préparés d'avance. Nous avons mélangé 1g de Saccharose et d'Albumine bovine chacun dans un tube de 10ml d'eau distillée.

Les cellules BHK21 destinées à la conservation sont traitées par la solution de trypsine avec le milieu DMEM 5% SVF et repartis dans des tubes de 50ml. Ces tubes sont ensuite mis dans la centrifugeuse à 800 rpm à 4°C pendant 3 min. Le surnageant est jeté. Le culot est reparti dans le milieu de conservation sans DMSO; soit environ 3,6 ml, puis 0,4 ml de DMSO sont ajoutés lors de la conservation. La solution est mélangée puis repartie dans des ampoules à raison de 1 ml dans chaque ampoule.

La conservation des cellules est une étape essentielle dans la culture cellulaire. Les cellules conservées sont utilisées en cas de besoin.

Faire une agitation par l'agitateur magnétique jusqu'à homogénéisation du milieu

Ajuster le pH à 10 avec NaOH N Préparation de la solution Tween 80 à 1,25%

Ajouter sous pH-mètre la solution d'Acide citrique 1N à la solution 1M de Citrate de sodium jusqu'à obtenir un pH 5

Le Tampon de saturation PBS-Tween-Gélatine 5% est un Tampon de saturation utilisé dans le test ELISA indirect pour occuper les sites qui sont restés vides après fixation de l'Ag rubéolique au fond des puits de la plaque ELISA. Il est utilisé aussi pour diluer les sérums à tester et le Conjugué anti IgG humain couplé à l'enzyme peroxydase.

Le Tampon de lavage PBS-Tween est utilisé pour faire le lavage après chaque étape du test ELISA.

Le Tampon Carbonate/Bicarbonate est utilisé pour effectuer les différentes dilutions de l'Ag rubéolique dans l'étape de sensibilisation de la plaque.

Le Substrat chromogène OPD est une solution révélatrice du complexe immun (Ac-Ag). Suite à la rencontre du Substrat chromogène OPD avec l'enzyme peroxydase fixé déjà sur le Conjugué anti IgG humain couplé à l'enzyme peroxydase, il va y avoir une réaction de dégradation et apparition de couleur orangée.

Le Conjugué anti IgG humain (SIGMA A-6029, LOT 84117381) est couplé a l'enzyme peroxydase. Ce Conjugue ne peut se fixer que sur le complexe immun (Ac-Ag).

La révélation du complexe immun (Ac-Ag) se fait grâce à l'enzyme peroxydase au contact avec le Substrat chromogène OPD.

Résumé: La culture cellulaire a été introduite dans les années 1920 et s'est grandement étendue au

cours des années 1940. Cette discipline est devenue importante dans divers domaines comme le domaine de virologie. La culture de certains virus a permis de résoudre plusieurs problèmes comme le diagnostic des maladies causées par ces virus.

L'objectif de notre projet de fin d'études consiste à maitriser la technique de culture cellulaire pour cultiver le virus de la rubéole sur la cellule BHK21. La culture de ce virus va nous permettre ensuite de réaliser le diagnostic de la maladie de la rubéole.

Les cellules BHK21 ont été infectées par le virus de la rubéole afin de produire l'hémagglutinine rubéolique. Cette étape va nous permettre d'assurer les autres étapes du procédé de la préparation d'un Kit de sérodiagnostic de la rubéole.

Pour le lot d'HA produit nous avons pratiqué la technique d'hémagglutination pour connaitre le titre de l'hémagglutinine rubéolique. Cette technique a donné un titre compris entre 512 et 1024 UHA. Ce titre est considéré comme élevé. La deuxième technique était le test ELISA. Ce test nous a permis de valider l'hémagglutinine rubéolique et de connaitre la dilution la plus élevée de l'antigène qui est de 1/100 avec une dilution de 1/50 pour le sérum. Avec ces dilutions nous avons trouvé une bonne concordance entre le Kit local et le Kit commercial moyennant des sérums de malade à titres préétablis par le service de Virologie clinique à L'institut Pasteur de Tunis.

Abstract: Cell culture was introduced in the 1920's and was greatly expanded in the 1940's.

This discipline became increasingly important in various fields such as the field of virology. Culture of certain viruses allowed to solve several problems such as the diagnosis of diseases caused by these viruses.

The aim of our final studies project is to study end master the technique of cell culture to grow rubella virus on BHK21 cell. The culture of this virus will then allow us to make the diagnosis of the rubella disease.

BHK21 cells were infected with rubella virus to produce rubella hemagglutinin. This step will allow us to ensure the further process steps for preparing a kit rubella serodiagnosis.

For the produced batch of HA we practiced the technique of hemagglutination to know the titer of the hemagglutinin rubella. This technique gave a titer between 512 and 1024 UHA. This titer is considered high. The second technique was the ELISA test. This test allowed us to validate the hemagglutinin rubella and to know the higher dilution of the antigen which is 1/100 and 1/50 of serum. With these dilutions we found good agreement between the local Kit and the commercial kit through infected serums of predetermined titer by the Pasteur Institute of Tunis's Clinical Virology department.