2.7. Détection et dosage de la Lp(a)
Pendant les années qui ont suivi sa
découverte, la Lp(a) n'a suscité que peu d'intérêt
par rapport aux autres lipoprotéines.
L'accumulation d'arguments cliniques l'associant
à la maladie athéroscléreuse d'une part, et la
découverte en 1987 de l'homologie de structure de l'apo(a) et du
plasminogène d'autre part, ont permis son entrée dans les
principaux facteurs de risque d'athérosclérose. Ce regain
d'intérêt a suscité le développement de techniques
de recherche et de dosage plus performantes.
Thèse Docteur Pharmacie La lipoprotéine Lp(a) :
son intérêt dans l'interprétation du bilan lipidique Dr
GUIMONT MC 129/271 Lipides, Lipoprotéine (a),
Hyperlipoprotéinémie, Athérosclérose, Lipids,
Lipoprotein, Lpa, Hyperlipoproteinemia, Atherosclerosis
2.7.1 Méthodes d'analyse qualitative
2.7.1.1. Appliquées à la
détection de la Lp(a) plasmatique
Etant donné que 80 p.cent des individus des
populations caucasiennes ont des taux de Lp(a) inférieurs au seuil
pathologique actuellement admis de 0,30 g/I et que les méthodes de
dosage ont un coût relativement élevé, il apparaît
raisonnable de procéder en première intention à une
recherche de la Lp(a) avant de pratiquer un dosage.
Méthodes
immunologiques
Immunodiffusion double selon
Ouchterlony
La méthode consiste à faire diffuser les
antigènes et les anticorps simultanément à partir de puits
creusés dans une couche de gélose. Selon les buts
cherchés, il est possible d'étudier les lignes de
précipitation obtenues entre un antisérum placé dans un
réservoir central et plusieurs antigènes ou mélanges
d'antigènes placés dans des réservoirs disposés
autour de lui (ou inversement : un mélange d'antigènes et
plusieurs antisérums). Cette méthode permet de mettre en
évidence une communauté antigénique entre deux
mélanges d'antigènes :
- si un seul et même antigène est
présent dans deux puits, on obtient une seule et même ligne de
précipitation vis à vis du même
antisérum,
- pour des antigènes différents les lignes
s'entrecroisent,
- s'il existe une communauté antigénique
sans identité totale des deux antigènes, il se forme un
éperon.
Application à la recherche de Lp(a)
:
Dans une étude de 1974, Walton utilise deux
antisérums d'origine animale différente (mouton et lapin) pour
tester une population de 1000 donneurs de sang. Les deux antisérums
détectent le même antigène mais l'antisérum de lapin
détecte 22,4 p.cent de sujets Lp(a) + alors que l'antisérum de
mouton en détecte 44,3 p.cent. Cette différence est liée
au "pouvoir anticorps" et à l'avidité différentes des
antisérums animaux vis à vis des antigènes humains. (Les
antisérums de mouton ont en général une meilleure
affinité et avidité pour les antigènes humains que ceux de
lapin).
Ainsi, la fréquence des sujets Lp(a) + dans une
même population dépend des qualités de l'antisérum
utilisé. Les auteurs ont de plus constaté qu'avec un même
antisérum, l'intensité des arcs de précipitation variait
nettement entre les différents sujets Lp(a) +. Ces deux constatations
suggèrent le caractère quantitatif du "trait" Lp(a)
275.
Electro immunodiffusion de
Laurell
Thèse Docteur Pharmacie La lipoprotéine Lp(a) :
son intérêt dans l'interprétation du bilan lipidique Dr
GUIMONT MC 130/271 Lipides, Lipoprotéine (a),
Hyperlipoprotéinémie, Athérosclérose, Lipids,
Lipoprotein, Lpa, Hyperlipoproteinemia, Atherosclerosis
Thèse Docteur Pharmacie La lipoprotéine Lp(a) :
son intérêt dans l'interprétation du bilan lipidique Dr
GUIMONT MC 131/271 Lipides, Lipoprotéine (a),
Hyperlipoprotéinémie, Athérosclérose, Lipids,
Lipoprotein, Lpa, Hyperlipoproteinemia, Atherosclerosis
Principe : un antisérum monospécifique
est incorporé dans une plaque de gel. Les antigènes à
tester sont répartis dans des puits alignés. L'application d'un
courant électrique perpendiculairement à la ligne des puits
accélère la précipitation des complexes
antigènes-anticorps dans le gel. Un halo en forme de fusée se
forme et progresse, tant que l'antigène est en excès.
En adaptant cette méthode à la recherche
de la Lp(a), Walton constate que la hauteur des pics varie nettement entre
individus positifs.
De plus, en comparant, l'immunodiffusion double et
l'électroimmunodiffusion avec le même antisérum de mouton
pour les 1000 donneurs de sang, l'immunodiffusion double révèle
44,3 p.cent de sujets positifs alors que l'électroimmunodiffusion en
révèle 75 p.cent. La sensibilité de cette technique est de
0,01 g/I de Lp(a) masse 275.
L'électroimmunodiffusion, beaucoup plus rapide
que l'immunodiffusion double, est donc également beaucoup plus
sensible.
Contre-immunoélectrophorèse
(électrosynérèse)
Principe : l'électrosynérèse est
une application de la méthode d'électro-immunodiffusion simple.
Elle permet de rechercher, par diffusion en milieu gélosé, la
présence d'un antigène au moyen d'un anticorps de
spécificité connue, la diffusion étant
accélérée par un champ électrique.
L'antigène et l'anticorps sont placés
l'un en face de l'autre dans les puits de la gélose qui est ensuite
reliée aux électrodes. L'antigène est placé du
côté de la cathode, l'anticorps du côté de l'anode.
Ils migrent l'un vers l'autre, et à leur point de rencontre, il
apparaît une ligne de précipitation.
La limite de détection est
évaluée à 0,285 g/I, cette méthode est moins
sensible que l'électroimmunodiffusion 2'6.
Rapide et peu chère, elle permet de
dépister les sérums ayant une Lp(a)
supérieure à 0,30 g/I de façon
fiable et spécifique. Elle est reproductible d'un
prélèvement à l'autre chez un même patient et ne
donne pas de faux positif.
Une hypercholestérolémie jusqu'à
16,8 mmol/I n'a pas d'incidence sur les résultats, par contre les
sérums dont la triglycéridémie est supérieure
à 14 mmol/I peuvent être l'objet de précipitations
atypiques.
Dépistage par ELISA sur goutte de sang
séché
Cette méthode a été
développée par Van Biervliet pour le dépistage des
concentrations élevées chez les nouveaux nés des familles
ayant un risque vasculaire connu. Le seuil pathologique choisi est égal
à 0,1 g/I d'après la distribution des concentrations chez les
nourrissons normaux.
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son intérêt dans l'interprétation du bilan lipidique Dr
GUIMONT MC 132/271 Lipides, Lipoprotéine (a),
Hyperlipoprotéinémie, Athérosclérose, Lipids,
Lipoprotein, Lpa, Hyperlipoproteinemia, Atherosclerosis
Une goutte de sang est déposée puis
séchée sur un papier filtre et un disque de 6 mm de
diamètre (5 ul de plasma) est élué, dilué et
mesuré par ELISA.
La sensibilité est égale à 0,01 g/I
27.
Dés 1974 Walton constate une importante
disparité dans les résultats de la fréquence
observée du caractère Lp(a) + entre les laboratoires
étudiant différentes populations et souligne dès cette
époque la nécessité de standardiser les méthodes et
les réactifs utilisés 275. Méthodes
électrophorétiques non immunologiques
Les lipoprotéines du fait de leur
hétérogénéité de composition relative en
protéines et lipides ont des charges électriques variables, ce
qui permet leur séparation par électrophorèse. La
classification des hyperlipoprotéinémies de Fredrickson est
basée sur la comparaison des tracés des sérums des
patients avec celui d'un sérum normal.
Divers supports sont utilisables pour séparer
les lipoprotéines mais leur capacité à mettre en
évidence la Lp(a) est variable.
Gel d'agarose
Sur ce support, la Lp(a) migre entre les
bêta-lipoprotéines et les
prébêtalipoprotéines, sous forme d'une fraction
appelée prébeta-1-lipoprotéine et visible à l'oeil.
Bruckert a évalue les performances de ce support pour le
dépistage des taux élevés de Lp(a), en étudiant 843
patients adultes et en excluant les sujets présentant une
hyperlipoprotéinémie de type Ill, une
hypertriglycéridémie supérieure à 10 g/I et les
patients traités par l'héparine. Les concentrations de Lp(a) sont
mesurées indépendamment par
néphélémétrie. En prenant comme seuil une
concentration supérieure à 0,30 g/I, la spécificité
se révèle excellente (97 p.cent), par contre la
sensibilité est médiocre (63 p.cent) ce qu'il explique par les
arguments suivants:
- les patients faux négatifs à
l'électrophorèse ont en moyenne une triglycéridémie
plus élevée. En effet l'augmentation des prébêta
lipoprotéines peut gêner la détection de la Lp(a) sur ce
support,
- la concentration moyenne en Lp(a) des faux
négatifs est proche du seuil de détection de 0,30
g/I,
- du fait de
l'hétérogénéité de taille de l'apo(a) et de
sa forte glycosylation, sa migration électrophorétique peut
être hétérogène.
De plus si l'électrophorèse n'est pas
effectuée sur sérum fraîchement prélevé, les
prébêtalipoprotéines voient leur mobilité diminuer,
tendant à se confondre avec la zone
prébêta-1-lipoprotéines empêchant ainsi la
visualisation de la Lp(a).
En pratique la migration en prébêta de la
Lp(a) rend son repérage difficile voire impossible sur sérum
conservé 278.
Gel d'agarose modifié
L'addition d'ions Mg++ au gel d'agarose permet de
diminuer la mobilité des toutes les fractions lipoprotéiques sauf
celle de la Lp(a). Cette procédure améliore nettement la mise en
évidence de la Lp(a) et surtout évite toute confusion avec les
prébêtalipoprotéines, même si l'échantillon a
été conservé quelques jours à +4°C (la
mobilité de la Lp(a) n'est pas affectée par la conservation
à 4°C). Il existe néanmoins une variabilité de
mobilité des fractions Lp(a) d'un individu à l'autre selon les
phénotypes d'apo(a), mais dans une zone étroite du
lipoprotéinogramme. Dans le cas de sérums très
hypertriglycéridémiques, la Lp(a) peut se trouver au sein des
prébêtalipoprotéines, il est alors conseillé de
refaire l'électrophorèse après quelques jours de
conservation à 4°C 279.
La sensibilité annoncée par le fabricant
est de l'ordre de 0,15 à 0,20 g/I de Lp(a) dosée en
électroimmunodiffusion. Ce support permet par ailleurs un typage fiable
des profils lipoprotéiques des patients. (cf. 3. Résultats
personnels)
Gel de polyacrylamide en
gradient discontinu d'acrylamide
Ce support adapté en tubes ou en plaques permet
une séparation fine des différentes classes de
lipoprotéines en fonction de la charge électrique et de la taille
moléculaire.
Dans l'adaptation en tubes, le sérum,
précoloré au nitrobleu de tetrazolium ou au noir Soudan, est
déposé à la partie supérieure d'un premier gel
à 2 p.cent d'acrylamide qui empêche la migration des chylomicrons
(ils restent au dépôt). Un deuxième gel à 3 p.cent
d'acrylamide retient les VLDL (qui restent à la jonction des 2 gels) et
fractionnent les autres lipoprotéines : les éventuelles IDL
s'immobilisent en premier, puis la Lp(a), les LDL et enfin les HDL.
Les séparations obtenues sur ce support
permettent une identification aisée des différents types
d'hyperlipoprotéinémies ainsi que la mise en évidence de
la Lp(a) dans 12 à 15 p.cent des sérums.
g/I 281
La limite de détection de la Lp(a) a
été déterminée par dilutions successives d'un
sérum très riche et dosé par électroimmunodiffusion
: elle est de 0,25 g/I pour l'adaptation en tube 121 280.
Pour l'adaptation en plaque (Lipofilm Sebia), la Lp(a) est perceptible
à 0,29 g/I et confirmée à 0,32
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