2.7.1.2. Appliquées à la
séparation des isoformes d'apo(a)
L'immunotransfert ou western blotting.
Le principe de la technique est de permettre la
visualisation d'antigènes, préalablement séparés
par électrophorèse, par réaction avec les anticorps
correspondants.
Pour son application au phénotypage de l'apo(a)
on effectue préalablement un traitement du sérum par un agent
réducteur de façon à libérer l'apo(a) de sa
liaison à l'apoB. Puis les
Thèse Docteur Pharmacie La lipoprotéine Lp(a) :
son intérêt dans l'interprétation du bilan lipidique Dr
GUIMONT MC 133/271 Lipides, Lipoprotéine (a),
Hyperlipoprotéinémie, Athérosclérose, Lipids,
Lipoprotein, Lpa, Hyperlipoproteinemia, Atherosclerosis
Thèse Docteur Pharmacie La lipoprotéine Lp(a) :
son intérêt dans l'interprétation du bilan lipidique Dr
GUIMONT MC 134/271 Lipides, Lipoprotéine (a),
Hyperlipoprotéinémie, Athérosclérose, Lipids,
Lipoprotein, Lpa, Hyperlipoproteinemia, Atherosclerosis
préparations sont soumises à une
séparation en fonction de leur poids moléculaire par
électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence d'un
détergent, le dodécylsufate de sodium (SDS-PAGE). Les
protéines ainsi séparées sont transférées
sous l'action d'un champ électrique, sur un film de nitrocellulose qui
reproduit fidèlement la migration des protéines et sur lequel
elles se fixent.
L'incubation de ce film avec un antisérum
spécifique puis la révélation des anticorps fixés
par un antisérum anti-immunoglobuline marqué par une enzyme
(peroxydase) aboutit à l'apparition de bandes colorées de
façon plus ou moins intense, identifiées par leur position par
rapport à des témoins de comportement connu dans le
système utilisé [apoB ou diverses apo(a)].
Dés 1984, Fless utilise cette technique pour
séparer les apo(a) isolées à partir des Lp(a) de 2
patients et met en évidence 3 espèces d'apo(a) de
mobilités différentes (inférieure, égale ou
supérieure à celle de l'apoB100) 118.
Dans les années 1987-88 Utermann affine la
méthode de séparation et surtout l'utilise dans plusieurs
études portant sur des populations importantes. Ceci lui permet
d'établir le concept du polymorphisme de l'apo(a), en mettant en
évidence 6 phénotypes définis par leur mobilité
relative à celle de l'apoB100.
Il montre qu'aucun individu ne présente plus de
2 phénotypes d'apo(a) différents. Les apo(a) de type F ont une
mobilité supérieure à celle de l'apoB100, le type B une
mobilité égale et les types S1, S2, S3, S4 des mobilités
inférieures et décroissantes.
La sensibilité de la technique d'Utermann est
de 90 ng de Lp(a) dans un volume équivalent à 1,8ul de
sérum utilisé pour l'électrophorèse (soit 0,05 g/I
de Lp(a) plasmatique).
Dans la population de 247 donneurs de plasma qu'il a
étudié, seulement 51 p.cent des individus se
révèlent positifs avec 1 ou 2 bandes (90 p.cent sont "simple
bande", 10 p.cent sont "double bande") alors que 77 p.cent ont des
concentrations mesurables en électroimmunodiffusion 131 139
282.
La fréquence de l'hypothétique
allèle nul va diminuer avec l'augmentation de sensibilité des
techniques.
Gaubatz utilise également la méthode du
westernblotting pour séparer les apo(a) mais à la
différence d'Utermann (qui dépose l'équivalent d'un
même volume de sérum pour tous les sujets), il dépose une
quantité équivalente d'apoprotéines de Lp(a) quelle que
soit la concentration de Lp(a) plasmatique. Cette procédure lui permet
de révéler la présence d'1 ou 2 bandes d'apo(a) chez 99,1
p.cent des 692 individus de la population qu'il étudie et de mettre en
évidence 11 isoformes différentes d'apo(a)
(numérotées de 1 à 11 des poids moléculaires les
plus faibles (419 kDa), aux poids moléculaires les plus
élevés, (838 kDa)).
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son intérêt dans l'interprétation du bilan lipidique Dr
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Lipoprotein, Lpa, Hyperlipoproteinemia, Atherosclerosis
Cette application de la technique du westernblotting
se révèle donc plus sensible et plus
résolutive.
Les 11 isoformes mis en évidence par Gaubatz
aboutissent à 66 phénotypes possibles numérotés de
1 à 66 dans l'ordre des poids moléculaires croissants. Les 11
phénotypes "simple bande" sont tous trouvés mais seulement 32 des
55 phénotypes "double bande" possibles. Dans sa population 59,5 p.cent
des individus sont "simple bande" et 39,6 p.cent "double bande". De plus la
distribution des phénotypes n'est pas régulière puisque
parmi les 8 plus fréquents, 7 sont simple bande 132.
Farrer applique cette méthode mais en variant
le volume de sérum en fonction de la concentration de Lp(a) afin de
déposer une quantité d'apo(a) comprise entre 0,06 et 2,00 ug
d'apo(a). La limite de détection correspond à une concentration
sérique de 7 mg/I.
Dans la population étudiée,
constituée de patients atteints de maladie coronarienne, tous les sujets
sont positifs ce qui peut s'expliquer par des concentrations de Lp(a) plus
élevées chez ces patients que dans une population de sujets
sains.
Il sépare 10 isoformes classées par leur
mobilité relative à celle de l'apoB100
(2 isoformes sont plus rapides, 1 est égale et
7 sont plus lentes). Cent p.cent des patients étudiés sont
positifs dont 62 p.cent simple bande et 38 p.cent double bande.
|
Rf
|
Poids moléculaires
kDa
|
Relation avec les isoformes d'Utermann et de
Gaubatz
|
|
|
|
|
1,1
|
- 403
|
Comparables à F d'Utermann
|
|
|
|
|
1,15
|
- 457
|
et 1 et 2 de Gaubatz
|
|
|
|
|
1,0
|
- 501
|
B selon Uterman
|
|
|
|
|
0,9
|
- 550
|
Comparables à S1, S2,
|
S3
|
et
|
S4
|
|
·
·
|
d'Utermann
|
|
|
|
|
0,35
|
- 1050
|
et à 4 à 10 de Gaubatz
|
|
|
|
Une classification dont la nomenclature est basée
sur la mobilité électrophorétique ou plus
précisément sur la mobilité relative Rf, (rapport de la
mobilité de la protéine à celle d'une molécule de
référence) a plusieurs avantages :
- pas d'ambiguïté dans les comparaisons des
résultats de différentes études,
- ouverture à l'isolement de nouvelles isoformes
et,
- application à l'études des apo(a) non
humaines 283.
Abe étudie les phénotypes d'apo(a) de 500
donneurs de sang japonais. Il utilise la classification d'Utermann et mesure la
mobilité vraie et relative à l'apoB des différentes
isoformes.
|
Isoforme
|
Mobilité vraie
|
Rf
|
|
S4
|
<0,057
|
0,28
|
|
S3
|
0,058 - 0,087
|
0,47
|
|
S2
|
0,088 - 1,190
|
0,65
|
|
S1
|
0,120 - 1,148
|
0,88
|
|
B
|
0,149 - 1,185
|
1,03
|
|
F
|
>0,186
|
1,32
|
Sur 500 sujets non apparentés 66,6 p.cent sont
simple bande, 25,4 p.cent double bande et 8 p.cent n'ont pas d'apo(a)
détectable. La concentration moyenne de Lp(a) sérique est 0,150
g/I et la médiane 0,110 g/I. La concentration des Lp(a) simple bande se
révèle significativement plus faible que celle des double
bande.
La fréquence des allèles est en accord avec
l'équilibre de Hardy-Weinberg.
Dosés par une technique ELISA dont la
sensibilité est de 0,023 g/I, 98 p.cent des sujets ont des
concentrations mesurables 284.
Huang modifie la technique d'Utermann et montre que
les facteurs qui influent la détection de la Lp(a) par westernblotting
sont :
- la concentration sérique de Lp(a)
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son intérêt dans l'interprétation du bilan lipidique Dr
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Hyperlipoprotéinémie, Athérosclérose, Lipids,
Lipoprotein, Lpa, Hyperlipoproteinemia, Atherosclerosis
- la quantité de sérum appliqué
à l'électrophorèse
- le titre et l'affinité du premier
anticorps-anti-Lp(a)
- les temps d'incubation avec le 1er et
le 2ème anticorps
- la sensibilité du système de
détection enzymatique.
La différence majeure qu'il propose par rapport
à Uterman 139 est un système de
détection plus sensible 285.
Sur 145 volontaires donneurs de sang, 11,7 p.cent sont
négatifs, 49,7 p.cent simple bande et 38,6 p.cent double
bande.
L'électrophorèse à haute
résolution en gel d'agarose-SDS, permet à Kamboch de mettre en
évidence, 23 isoformes. En effet, les pores du gel d'agarose, de plus
grande taille que ceux du gel de polyacrylamide, favorisent un effet de
tamisage moléculaire permettant la séparation des isoformes de
grande taille.
Les isoformes sont numérotées de 1 à
23, par poids moléculaires décroissants.
L'auteur montre aussi qu'en général, les
isoformes de faible poids moléculaire sont plus intensément
colorées que celles de plus fort poids moléculaire et que cette
différence est conservée au sein des familles 137.
La méthode utilisée ne lui permet pas
d'établir de correspondance entre ses isoformes et ceux d'Utermann et
Gaubatz, mais en analysant les distances de migration obtenues, il
prévoit l'existence de 14 isoformes supplémentaires. Cette
étude, réalisée sur 130 enfants issus de 54 familles,
permet à Kamboch de confirmer le caractère
héréditaire des isoformes de l'apo(a).
Marcovina améliore la méthode de Kamboch
et sépare 34 isoformes d'apo(a) avec une résolution au kringle
près 139.
2.7.2 Méthode d'analyse quantitative
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