Memoire Online - Contribution à l'étude de la qualité bactériologiques des huitres fraiches dans l'aire marine protégée du petit Kassa (Casamance)

Le matériel de préparation des échantillons d'huîtres destinés aux analyses bactériologiques comprend :

Le matériel d'analyse microbiologique des coquillages correspond aux instruments communément rencontrés dans les laboratoires de microbiologie des aliments notamment :

- le matériel de stérilisation (four Pasteur, autoclave, cocotte minute, bec Bunsen)

- le matériel de dilution et d'ensemencement (pipette, tubes à essais, boîte de Pétri, étaleur, milieu de culture et réactif)

- les appareils d'incubation (étuve à 30°c, 37°c, 44°c, 46°c) et de distillation de l'eau

2.1.2 Méthodes

L'étude de la qualité bactériologique a porté sur des huîtres provenant des quatre villages de l'AMPc du petit Kassa (Bakassouk, Haer, Hitou et Niomoune) soumises au dégorgement à Katacalousse. Les huîtres récoltées par les femmes dans les villages de l'AMPc sont dégorgées artisanalement à Katacalousse sur des tables en bois implantées dans l'eau. Deux échantillons de douze huîtres ont été prélevés par village. Les échantillons prélevés sont conditionnés dans des sachets en plastique troués stériles et conservés dans une glacière contenant de la glace. Ils sont ensuite transportés au laboratoire à Dakar pour des analyses bactériologiques. Des échantillons d'eau ont été également prélevés dans différents endroits du site de dégorgement.

La durée du voyage entre le lieu de prélèvement et le laboratoire est de 24 heures.

Le protocole d'analyse bactériologique comporte la préparation des échantillons (fig. 6) et la recherche des germes.

La recherche des germes comprend les dilutions et les analyses qualitatives et quantitatives de dénombrement.

Des dilutions de 10 en 10 ont été effectuées à partir de la solution ou suspension mère à 10^-1 en prélevant à chaque fois 1 ml ajouté à 9 ml d'eau salée à 10/°° contenue dans un tube à essai. Les dilutions 10^-2, 10^-3, 10^-4, ont été ainsi réalisées.

La FMAT, encore dénommée flore totale, représente l'ensemble des germes contenus dans l'échantillon. Ces germes sont recherchés aux dilutions 10^-1 et 10^-2.

L'ensemencement s'effectue à partir de 1 ml prélevé dans le flacon de la suspension mère à 10^-1 et dans le tube à essai 10^-2. L'échantillon de 1 ml prélevé est transféré dans des boîtes de Pétri stériles, où est ajoutée une première couche de la gélose Plat Count Agar (P.C.A) fondue en bain Marie, puis refroidie. Le mélange contenu dans des boîtes de Pétri est homogénéisé par mouvement rotatif, vertical ou transversal. Il est ensuite mis à solidifier sur la paillasse à coté du bec Bunsen (boîtes fermées). Après solidification de la première couche de PCA, chaque boîte de Pétri reçoit une deuxième couche de PCA ou gélose nutritive. L'ensemble est ensuite remis en solidification. Les boîtes de Pétri ainsi ensemencées sont incubées à l'étuve à 30°c en position retournée pendant 72 h et la lecture s'effectue en donnant les résultats en nombre de germes par millilitre.

1 ml des dilutions 10^-1 et 10^-2 est réparti dans deux boîtes de Pétri et mélangé avec de la gélose (VRBL) qui permet le développement des coliformes. Les boîtes prêtes sont incubées à 44°c pendant 24h à 48h avant leur lecture, qui donne un résultat exprimé en nombre de germes par millilitre.

Ils sont dénombrés sur le milieu sélectif de Baird Parker additionné de jaune d'oeufs et de tellurite de potassium. L'ensemble du mélange est solidifié dans une boîte de Pétri. Cette boîte de Pétri ainsi préparée est ensemencée avec 0,1 ml de la dilution 10^-1 ; cette dernière est étalée en surface à l'aide d'un râteau en verre stérile puis à la flamme. L'incubation est effectuée à 37°c pendant 24h à 48h. La lecture à l'issue de la durée d'incubation conduit à l'observation de deux types de colonies :

L'identification se réalise à l'aide de deux tests : l'épreuve de la Dnase et de la coagulation.

Les milieux Tryptose Sulfite à la Cyclosérine (TSC) ou les milieux Trypticase Sulfite Néomycine (TSN) sont préférés aux milieux Wilson Baisol du fait qu'ils sont plus sensibles, plus sélectifs et rendent inutile le chauffage de la suspension mère à 80°c pendant 5 mn.

Le milieu TSN est celui utilisé au cours de l'étude bactériologique des coquillages. Il est réparti par 10 ml dans des tubes à essais. Ces derniers sont mis à liquéfier au bain Marie, puis refroidis avant leur ensemencement effectué avec 1 ml des dilutions 10^-1 et 10^-2. Après homogénéisation et solidification des mélanges, les tubes sont incubés à 46°c pendant 24 à 48h en anaérobiose stricte, celle-ci est obtenue à l'aide d'une jarre spéciale à anaérobiose.

La lecture est effectuée par dénombrement des grosses colonies noires, cotonneuses, circonscrites.

Le prélèvement de 25 g (25 ml) de la chair et du liquide intervalvaire se justifie par la recherche de Salmonelles du fait que les normes réglementaires recommandent l'absence de Salmonelles dans 25 g de chair ou 25 ml d'eau intervalvaire. Cette recherche des Salmonelles comporte quatre étapes principales, dont :

- le pré-enrichissement : la suspension mère de dilution 10^-1 est incubée à 37°c pendant 24h, à l'issue desquelles une odeur nauséabonde permet la suspicion ;

- l'enrichissement : les 2 ml prélevés dans la suspension mère sont mélangés à 20 ml de bouillon au sélénite de sodium en tube et le tout est incubé à 37°c pendant 24 h une coloration rose-rouge renforce la suspicion ;

- l'isolement : la gélose au Désoxycholate Citrate Lactose Saccharose est un milieu sélectif, celle-ci est écoulée puis solidifiée en boîte de Pétri. L'ensemencement s'effectue en surface par stries à l'aide d'un ose plongé dans le milieu enrichi. La boîte ensemencée est incubée à 37°c pendant 24 h. L'observation des colonies incolores ou blanchâtres renforce d'avantage la suspicion :

- l'identification : le milieu Kligler Hajna initialement rouge est ensemencé par piqûre au niveau du culot et par une strie médiane au niveau de la pente. Ensuite, le milieu ainsi ensemencé est étuvé à 37°c pendant 24 h. La lecture s'effectue par appréciation sur la pente et dans le culot.

Les Vibrio sont recherchés dans les produits halieutiques, en particulier les huîtres. Cette recherche s'effectue d'abord sur milieu Thiosulfate Citrate Bile Saccharose. Ce milieu est coulé dans des boîtes de Pétri. Après solidification du contenu, celui-ci est ensemencé avec 0,1 ml des dilutions 10^-1, 10^-2 ou 10^-3. Seules les dilutions 10^-3 donnent des colonies bien isolées et bien distinctes. Le volume 0,1 ml ensemencé dans chaque boîte de Pétri est étalé en surface à l'aide d'un râteau en verre stérile (après passage à l'alcool, puis à la flamme).

Après 24 h d'étuve à 37°c, la lecture s'effectue par identification de colonies suspectes caractérisées par une coloration verdâtre. Les colonies suspectes sont soumises à la coloration de Gram.

Le tableau 4 présente les résultats des analyses d'eau. L'analyse de l'eau révèle une contamination par les Staphylococcus aureus à 37^°C, (30 dans 100ml) et par les ASR qui sont supérieurs à 1/20ml. Les Salmonelles et les coliformes n'ont pas été détectés dans les échantillons d'eau analysés.

Micro-organismes recherchés	Références des méthodes d'analyse	Résultats de l'analyse	Critères de référence pour l'interprétation des résultats (arrêté ministériel français du 21 décembre 1979 abrogé critères internes)
Micro-organismes aérobies à 22^oC 37^oC	NF EN ISO 6222	84 85	20/ml 10²/ml
Coliformes fécaux à 44^oC	NF V08-060	Absence	Absence /100ml
Staphylococcus aureus à 37^oC	NF V08-057-1	30	Absence /100ml
Anaérobies Sulfito- Réducteurs	NF EN ISO 7937	>1/20	1/20ml
Salmonelles	NF EN ISO 6579	Absence	Absence dans 5 litres

L'analyse bactériologique des huîtres non traitées prélevées à Katacalousse montre une contamination totale des huîtres avec 8,4.10⁴ de micro-organismes aérobies mésophiles à 30^oC et 8.10³ Staphylococcus aureus à 37^oC et ASR 1,2.10² (tableau 7). Les Vibrio et les Salmonelles qui sont des agents pathogènes pour l'homme n'ont pas été détectés.

Tableau 7 : Résultats des analyses bactériologiques des huîtres vivantes non traitées

Micro-organismes recherchés	Références des méthodes d'analyse	Résultats de l'analyse	Critères de référence pour l'interprétation des résultats (arrêté ministériel français du 21 décembre 1979 abrogé critères internes)
Micro-organismes aérobies mésophiles à 30°C	NF EN ISO 4833	8,4.10⁴	5.10⁴/g
Coliformes fécaux à 44°C	NF V08-060	<10	3.10²/10g
Staphylococcus aureus à37°C	NF V08-057-1	8.10³	10²/g
Anaérobies Sulfito-réducteurs à 37°C	NF EN ISO 7937	1,2.10²	10/g
Vibrio	NF EN ISO 8914	Absence	Absence/g
Salmonelles	NF EN ISO 6579	Absence	Absence dans 25g

Les résultats présentés dans le tableau 8 montrent une contamination des huîtres vivantes traitées par l'eau de javel par des bactéries pathogènes surtout les ASR à 37°C avec 10², Staphylococcus aureus à 37°C 4.10² et la flore totale à 30°C 6.10⁴. En revanche, les Vibrio et les Salmonelles n'ont pas été détectés.

Tableau 8: Résultats des analyses des huîtres vivantes traitées avec de l'eau de javel.

Micro-organismes recherchés	Références des méthodes d'analyse	Résultats de l'analyse	Critères de référence pour l'interprétation des résultats (arrêté ministériel français du 21 décembre 1979 abrogé critères internes)
Micro-organismes aérobies mésophiles à 30°C	NF EN ISO 4833	6.10⁴	5.10⁴/g
Coliformes fécaux à 44°C	NF V08-060	<10	3.10²/g
Staphylococcus aureus à 37°C	NF V08-057-1	4.10²	10²/g
Anaérobies Sulfito-Réducteurs à 37°C	NF EN ISO 7937	10²	10/g
Vibrio	NF EN ISO 8914	Absence	Absence/g
Salmonelles	NF EN ISO 6579	Absence	Absence dans 25g

Contribution à l'étude de la qualité bactériologiques des huitres fraiches dans l'aire marine protégée du petit Kassa (Casamance)

2. Analyses bactériologiques

2.1.2 Méthodes