2.6.2. Lyse virale des phages dans les plugs
d'agarose
Une préparation de 5 mL de tampon de lyse [(Phage Lysis
: 50 mM Tris, 50 mM EDTA, pH 8,0), et SDS à 1 %] additionné de 25
ìL de protéinase K à 20 mg/mL est mis un tube de 5mL. Les
tubes sont ouverts délicatement, les plugs d'agarose sont
rétirés des moules et transférés dans les tubes
correspondants. Ces tubes sont alors placés dans un bain-marie à
54 °C pendant 2 heures. Le tampon de lyse est soigneusement
éliminé des tubes à l'aide d'une pipette par aspiration.
Les plugs sont lavés avec 5 mL de tampon TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH
8,0) stérile qui est chauffé à 54 °C pendant 15 min
dans un bain d'eau sous faible agitation. Les tubes contenant les plugs sont
rétirés du bain-marie, et le tampon est aspiré
soigneusement en veillant à ce que les plugs ne soient pas
cassés. Cette opération de lavage avec le tampon TE est
répétee trois fois et deux fois avec de l'eau. Cependant le
tampon est changé après chaque lavage. Les plugs sont alors
stockés à +4 °C jusqu'à ce qu'ils soient prêts
à être soumis à digestion par les enzymes de restriction
(Figure 6).
2.6.3. Digestion enzymatique du génome
Les plugs d'agarose sont soumis à une
pré-digestion selon le mélange réactionnel
(Tableau VIII) avant de réaliser une digestion
enymatique proprement dite selon le mélange réactinnel
(Tableau IX) dans un bain marie à 37 °C pendant 2
heures. Les plugs de phages sont rétirés du tampon TE avec un
petit spatule plate désinfecté à l'éthanol,
coupés à l'aide d'un bistouri ou une lame de scalpel, le long de
l'axe des bouchons en faisant des tranches d'environ 2 mm de la longueur prise.
Les portions restantes
Matériel et Méthodes
des bouchons sont stockés à 4°C dans le
tampon TE. Les plugs découpés sont placés dans un volume
de 200 uL de tampon de restriction dilué à 1X de concentration
pour une pré-digestion (Tableau VIII), puis
incubés à 37°C pendant 10 à 15 min à la
température ambiante. Après l'incubation, le tampon est
aspiré à l'aide d'une micropipette et 200 uL de master mix de
digestion (Tableau IX) est ajouté à chaque tube
puis incubé à la température appropriée de l'enzyme
XbaI ou XhoI pendant 2 heures. Après l'incubation, le tampon de
restriction est aspiré puis les plugs découpés sont mis en
suspension dans 200 uL de TBE 0,5X pendant 5 min (Figure
6).
2.6.4. Électrophorèse sur gel
d'agarose
Avant la migration, un gel d'agarose de 1% est
préparé dans un tampon de TBE 0,5X puis conservé au bain
mari à à 55 °C. Ensuite, la cuve
d'électrophorèse en champ pulsé CHEF-DRIII system (Bio-Rad
Laboratoires) est remplie avec 2,2 litres de tampon 0,5X et l'automate est
laissé allumer jusqu'à ce que la température de la cuve de
migration passe à 14°C. Parallèlement les plugs
découpés sont déposés le long du peigne. On laisse
refroidir entre 45-50 °C et le gel préparé est
conservé à 55 °C avant de le couler dans la direction de la
longueur de l'axe. Après que le gel soit solidifié avec les plugs
sur le peigne, on rétire le peigne puis on le dépose dans la cuve
électrophorèse. L'électrophorèse est
réalisée à 14°C avec un voltage à 6 V/cm,
pendant 6 heures avec un temps de pulsation de 2,0-12,0 sec, et un angle de
120° (des temps d'impulsion peuvent être nécessaires pour
optimiser la séparation des bandes) (Figure 6). Une
fois la migration terminée, le gel est immergé dans une solution
de sybr safe 10000X (40 uL dans 400 mL d'eau déionisée) pendant
30 min sous une faible agitation. Le gel est ensuite décoloré
dans 500 mL d 'eau désionisée pendant 20 min et à chaque
10 min l'eau désionisée est changée. Le gel est
examiné à l'aide d'un automate appélé GelDoc
(BioRad Laboratoires) couplé à un ordinateur puis capturé,
imprimé et enregistré l'image du gel coloré avec un
système de documentation de gel.
33
Matériel et Méthodes
Tableau VIII : Mélange réactionnel
de la pré-digestion enzyamtique du PFGE
|
Réactifs
|
Volume de réactifs par plug
(bouchon) en
ìL
|
Volume de réactifs pour 10
plugs (bouchon) en
ìL
|
|
H20
|
180
|
1800
|
|
Buffer 10X Enzyme
|
20
|
200
|
|
Volume Total
|
200
|
2000
|
Tableau IX: Mélange réactionnel de
la digestion enzyamtique du PFGE
|
Réactifs
|
Volume de réactifs par plug
(bouchon) en
ìL
|
Volume de réactifs pour 10
plugs (bouchon) en
ìL
|
|
H20
|
173
|
1730
|
|
Buffer 10X Enzyme
|
20
|
200
|
|
BSA 10 ìg / ìL
|
2
|
20
|
|
XbaI ou XhoI 10 U/ ìL
|
5
|
50
|
|
Volume Total
|
200
|
2000
|
Matériel et Méthodes
| 
