2.5. Electrophorèse sur gel d'agarose
Avant la migration, un gel d'agarose à 0,8% est
préparé dans le tampon TAE 1X puis coloré avec 3 ìL
de Sybr Safe (10000X). Un volume de 20 ìL d'extrait d'ADN sont
mélangés à 4 ìL de tampon de charge (colorant Blue
6X). Le mélange obtenu est déposé dans un puit du gel et
soumis à une migration à 100 Volt pendant 2 heures jusqu'à
ce que le front du colorant soit proche du fond du gel. La
révélation s'est faite sous UV sur Gel DOCTM EZ
(BioRad) pour visualiser la présence de bandes d'ADN.
2.6. Electrophorèse en champ pulsé
L'électrophorèse en champ pulsé s'est
déroulée en 4 étapes.
Une étape d'encapsulation des phages dans l'agarose,
une étape de lyse des phages et de libération des génomes,
une étape de digestion enzymatique par les endonucléases et une
étape de migration sur gel d'agarose suivi de l'analyse et de
l'interpretation des résultats (Figure 6).
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Matériel et Méthodes
Figure 6 : Schéma descriptif de
l'électrophorèse en champ pulsé
1 :Encapsidation des phages dans l'agarose ;
2 : Lyse virale et caqqure des protéines de la capside
avec la protéinase K ; 3 : Digestion enzymatique de
l'ADN avec les endonucléases ; 4 : Migration
électrophorétique et analyse et interpretation des
résultats.
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Matériel et Méthodes
2.6.1. Encapsidation des phages dans l'agarose
Une solution d'agarose est préparée par
mélange de 0,1 g d'agarose (concentration finale à 1% ; Pulsed
Field Certified agarose, Bio-Rad, France) et 10 mL de tampon TBE porté
à 100 °C. Après dissolution complète de l'agarose, la
solution est placée dans un bain à 55 °C pendant 5
minutes.
Parallèlement les phages purifiés sont
placés dans le tampon Phage Suspension (100 mM Tris, 100 mM EDTA, pH
8,0), puis un volume total de 0,5 -1 mL de suspension de phages purifiés
est maintenu dans un bain marie ou bloc chauffant à 50 - 54 °C et
un volume de 400 uL cette suspension de phage est tranférée dans
des tubes eppendorf de 2 mL. Après homogénéisation, 400
ìL de la préparation d'agarose (1% d'agarose) conservée
à 55 °C sont ajoutés et mélangés doucement
avec la suspension phagique maintenue à 50 - 54°C par aspiration et
refoulement avec une pipette sans qu'il n'y ait de bulles d'air. Ce
mélange est ensuite immédiatement réparti dans les moules
à plugs, à raison de 100 ìL par plug. Ceux-ci sont
laissés à température ambiante pour se solidifier ou
à + 4 °C pendant 10 à 15 min (Figure 6).
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