2.4. Digestion
enzymatique
2.4.1. Principe
Les enzymes de restriction sont des endonucléases
capables de reconnaître spécifiquement une courte séquence,
de 4 à 10 pb et de cliver les liaisons phosphodiesters entre 2
nucléotides à l'intérieur de l'ADN double brin au site
reconnu. Ils permettent de fragmenter l'ADN en segments de taille
réduite, ou de le couper à tel ou tel site désiré.
Certains enzymes coupent le site en son milieu et produisent deux fragments
dont les extrémités sont franches. Cependant, la plupart
réalisent une coupure dissymétrique :
Matériel et Méthodes
on parle dans ce cas d'extrémités cohésives
(chaque fragment possède une chaîne qui dépasse l'autre de
quelques bases).
2.4.2. Protocole
L'ADN de bactériophage est mis à digérer par
chaque endonucléase (XbaI, XmnI) et incubé à 37 °C
pendant 4 heures en présence d'un tampon RE 10X buffer et de bovin serun
albumin (BSA) fourni par le fabricant (Tableau VII).
Après incubation, les produits obtenus ont
été séparés sur gel d'agarose à 0,8% dans du
tampon TAE 1X (Promega) contenant 3 ìL de Sybr Safe (10000X)
(Invitrogen) à 100 volt pendant 2 heures.
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Matériel et Méthodes
Tableau VII : Mélange réactionnel
de la digestion enzymatique
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Réactifs
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Quantité
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H2O
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12,3 jiL
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RE 10X Buffer &
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2 jiL
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Acetylated BSA, 10 jig! jiL
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0,2 jiL
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Enzyme de restriction 10U! jiL
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0,5 jiL
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ADN phage
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5 jiL
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Température d'incubation
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37 ° C
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Temps d'incubation
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4 heures
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&RE 10X Buffer contient à 1X : pH 7,5
à 37°C ; Tris-HcL 6 mM ; MgcL2 6 mM et NaCL 6 mM.
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Matériel et Méthodes
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