2.2. Extraction de l'ADN des phages
2.2.1. Principe
L'extraction de l'ADN est une technique qui permet d'isoler l'ADN
à partir d'une cellule en
quantité et en qualité suffisante pour permettre
son analyse. Elle comporte plusieurs étapes à savoir la
libération de l'ADN et des différents constituants cellulaires
suivie d'une lyse par digestion enzymatique avec la Protéinase K; la
déproteinisation des proteines membranaires par le
Phénol-Chloroforme- Alcool Isoamylique (25:24:1) et la purification
sélective de l'ADN par précipitation avec l'Alcool-Isopropanol
qui aboutit à la formation d'un culot (précipité).
2.2.2. Protocole
Des particules de phages préalablement purifiées
(10-10-1011 PFU / mL) sont traitées avec 20
ìL
de DNase I (1mg / mL) et 15 ìL de RNase A (4 mg / mL)
à 37 O C pendant 30 minutes. Dix microlitres de protéinase K (20
mg / mL) et 50 ìL de SDS (10 %) sont ajoutés à la solution
obtenue, puis le tout est incubée à 56 O C pendant 30 minutes.
Après l'incubation, un volume de 500 ìl de
Phénol-Chloroforme-Alcool Isoamylique (25 : 24 : 1) sont
additionnés au mélange qui est ensuite centrifugé à
10 000 rpm
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Matériel et Méthodes
pendant 2 minutes pour séparer les phases. Cette
opération d'ajout de phénol-chloroforme-alcool isoamylique suivi
de la centrifugation est répétée trois fois. La phase
aqueuse (phase supérieure) est transférée dans un nouveau
micro-tube de 1,5 mL puis 500 ìL d'isopropanol (100 % glacial) et 50
ìL d'acétate de sodium (3 M) y sont ajoutés. Après
une incubation de 10 min sur la glace (pour permettre la précipitation),
le mélange est centrifugé à 14 000 rpm pendant 15 min
à 4 ° C. Le culot d'ADN est lavé deux fois avec 200
ìL d'éthanol à 70% et séché à l'air
ou à 65° C dans le Thermoblock pendant 15 min. L'acide
nucléique est mis en suspension dans 50 ìL de TE (Tris-HCl 10 mM,
pH 7,0, EDTA 1,0 mM, pH 7,0) selon la procédure standard
(Sambrook et al., 1989 ; Sambrook et Russell
2001).
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