8.3.Recherche des coliformes totaux à 37°C
(test de présomption)
La technique utilisée est celle de Mac Grady (NPP :
nombre le plus probable), méthode de dénombrement des coliformes
en milieu liquide (Institut pasteur, 1999).
- Une série de tubes munis d'une cloche de durham
contenant 10ml de VBL est préparée
(milieu sélectif liquide) à raison de deux tubes
par dilution.
- A partir des dilutions décimales allants de
10-3 à 10-1 est transféré à
l'aide d'une pipette
graduée 1ml dans chacun des deux tubes
correspondant à une dilution donnée.
- Le gaz présent dans les cloches est chassé.
- Le milieu et l'inoculum est bien mélangé.
8.4.Recherche des coliformes thermotolérants
à 44°C (test de confirmation)
En se référant à la technique de Mac
Kenzie, méthode de dénombrement des coliformes
thermotolérants à partir des réactions positives du test
de présomption :
- On procède au repiquage des tubes de VBL
trouvés positif lors de dénombrement des
coliformes totaux,
- A partir de ces tubes, on transfert aseptiquement au moyen
d'une pipette pasteur,
quelques gouttes à la fois dans :
CHAPITRE II
MATERIELS ET METHODES
54
? Un tube contenant 10ml de VBL muni d'une cloche de Durham et ?
Un tube contenant 5ml d'EPEI.
- On chasse le gaz présent dans les cloches, et on
mélange bien le milieu et l'inoculum.
- Après l'incubation, on ajoutera à chaque tube
d'EPEI 2 à 3 gouttes du réactif de Kovacs
(Institut pasteur, 1999).
8.5.Recherche des Staphylococcus aureus
Pour la recherche des Staphylococcus aureus, on a
suivi la méthode d'enrichissement sélectif sur milieu Giolliti
Cantoni (Bouillon d'enrichissements sélectif) mélangé
aseptiquement et soigneusement avec son additif tellurite de potassium
(ampoule).
8.5.1. Enrichissement à 37°C
On prélève aseptiquement 1ml de chacun des
dilutions 10-1, 10-2 et 10-3 qu'on transfert
par la suite au moyen des pipettes graduées dans des tubes contenant
25ml de bouillon Gioliti Cantoni.
8.5.2. L'isolement à 37°C
A partir des tubes ayant viré au noir (afin de
s'assurer qu'il s'agit bien d'un développement de
staphylococcus pathogène), on ensemence aseptiquement en strie
la surface du milieu Chapman. Ce dernier est un milieu sélectif
permettant l'isolement et l'enrichissement des staphylococcus
pathogène. Il est préalablement coulé en boites
pétri et solidifié.
8.5.3. Identification des résultats
En cas de présence de colonies typiques ou
caractéristiques (colonie avec un halo jaunes lumineux, mannitol
positif) sur le milieu Chapman (Afnor, 2004), on peut
procéder à des tests confirmatifs pour s'assurer qu'il s'agit
bien de staphylococcus aureus.
8.5.3.1.Prés-identification des
Staphylococcus
Les souches pures de cocci Gram+ doivent tout d'abord être
soumises à une pré-identification en procédant aux tests
de catalase, Staphylocoagulase et DNase Test Agar.
Catalase
Elle a pour but de classifier des bactéries
aérobies et plus spécialement de différencier.
CHAPITRE II
MATERIELS ET METHODES
55
CHAPITRE II
MATERIELS ET METHODES
Il s'agit d'une enzyme qui a la propriété de
décomposer l'eau oxygénée avec dégagement
d'oxygène.
A l'aide d'un ance, on prélève aseptiquement une
colonie typique suspectée d'être celle de staphylococcus
aureus et on la mélange avec quelques gouttes d'une solution
fraiche de H2O2 placée sur lame, un dégagement gazeux abondant
sous forme de bulle traduit la décomposition de l'eau
oxygénée sous l'action de la catalase (Guiraud,
2000)
Staphylocoagulase
Elle a pour but de déterminer la
pathogénicité d'une staphylococcus qui secrète
une enzyme la staphylocoagulase qui a la propriété de coaguler le
plasma.
- A partir d'un Chapman déjà ensemencé,
on prend aseptiquement une colonie ayant
fermenté le mannitol.
- On la met dans un tube contenant le bouillon coeur-cervelle.
- On va placer à l'étuve de température
37°C pendant 18 à 24 heures.
- Dans des conditions d'asepsie, 0,5ml de culture (colonie +
BHIB) mis au contact avec
0,5ml de plasma du lapin (remplacer par plasma d'humain)
dilué au 1/5 dans un tube à hémolyse.
- L'ensemble est incubé à 37°C et
examiné toutes les 1/2 heures pendant une demi-
journée.
La coagulation se traduit par la prise en masse du contenu du
tube qui peut être retourné
(Guiraud, 2000).
Test de DNase
On ensemence le milieu de DNase à partir d'une culture
pure (de 18 à 24 heures) de staphylocoque sur milieu BN dans une bande,
ou déposer la croissance en un point, à l'aide d'un ensemenceur
à anse. Il est possible d'ensemencer jusqu'à quatre souches de
Staphylocoques sur une même boîte de Pétri. Il est
recommandé d'inclure un témoin positif, par exemple : S.
aureus. Incuber les boîtes de Pétri en conditions
aérobies pendant 18 à 24 h entre 35 et 37 °C. Si des souches
d'autres espèces de bactéries ou de champignons sont
testées, ensemencer conformément aux conditions requises.
Après incubation, recouvrir les boîtes de Pétri avec
une quantité suffisante de solution d'acide chlorhydrique (HCl) 1 N.
Attendre 2 min afin de permettre à l'acide de pénétrer
toute la surface du milieu (Kateete et al, 2010).
56
Une fois que l'acide a été appliqué et
laissé pénétrer dans le milieu, les microorganismes
positifs à la DNase, comme Staphylococcus aureus ou
Serratia marcescens, sont entourés de zones claires d'ADN
dépolymérisé, tandis que les parties du milieu plus
éloignées de la bande d'ensemencement sont opaques et
blanchâtres, sous l'effet de l'ADN polymérisé. Les colonies
de microorganismes négatifs à la DNase ne présentent pas
de zones plus claires en périphérie des colonies.
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