CHAPITRE II
MATéRIELS ET MéThODES
Chapitre II Materiels et Méthodes
II.1.Appareils et produits chimiques
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Appareils
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Produits chimiques et réactifs
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- Incubateur avec un système d'agitation et de
régulation de température, New Brunswick Sientific.
- Autoclave, SELECTA.
- Bain-marie agité, Bioblock Scientific.
- pH mètre, MeterLab. - Spectrophotomètre,
SPECTRONIC 20 Genesys.
- Balance de précision, KERN ALJ 220-4M.
- Vortex, stuart.
- Centrifugeuse, Hettich EBA 12. - Centrifugeuse, SIGMA 3- 16 PK.
- Agitateur magnétique, Heidolph. - Agitateur magnétique,
Fisher
Scientific.
- Lecteur de microplaque, Biotek.
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- Mg SO4.7H2O, Fluka.
- Fe SO4.7H2O, Panreac. - FeCl3.6H2O, Panreac.
- ZnSO4.H2O, Merck.
- Cu Cl2.2H2O, Riedel-de Haën. - Mn SO4. H2O, Prolabo.
- Na2 HPO4, Fluka.
- KH2PO4, SIGMA-ALDRICH.
- Na Cl, Scharlau.
- (NH4)2 SO4, SIGMA-ALDRICH.
- -CaCO3, Prolab.
- Glucose, SIGMA-ALDRICH.
- Urée, SIGMA-ALDRICH.
- Thiamine, SIGMA.
- Biotine, SIGMA-ALDRICH.
- Ca Cl2, Fluka.
- Bitaine, Sigma.
-Acide sulfurique 96%, SIGMA-ALDRICH.
- NaOH, Biochem Chemopharma.
- Kit enzymatique pour le dosage du glutamate, r-
biopharm.
Chapitre II Materiels et Méthodes
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II.2.Microorganisme utilisé
La souche utilisée dans ce travail est un
Corynebacterium glutamicum 2262, qui a été fourni par le
laboratoire de Génie des Procédés Biotechnologique,
(Institut National Polytechnique de Lorraine Nancy - France). Les
caractéristiques de la souche sont présentées dans le
tableau (Collins et Cummins, 1986).
Caractères principaux
· Bactérie à Gram positif
· Bacille : droit ou légèrement
incurvé, ovale, massue, souvent réarrangées en V
· Colonies jaunes pâle à jaune,
régulières et lisses sur gélose
· Dimension : 0,7 à 1 um x 1 à 3 um
· Auxotrophe pour la biotine
· Non-sporulant
· Non-mobile
· Alcoolo-acido-résistantes
· Aérobie facultative
· Production d'acide glutamique
· % G+C : 53 à 58%
· Paroi : présence d'acide
méso-diaminopimétique et d'arabinogalactane Condition de
culture
· pH optimal de croissance : 7,3 à 7,4
· Température optimale de croissance : 25
à 37°C Substrats consommés (+) ou non
consommés (-)
· (+) Glucose, Frucose, Saccharose,
Maltose, Tréhalose et Mannose
· (-) Rhamnose, Galactose, Raffinose,
Arabinose, Lactose, Xylose, Dextrine, Salicine, Amidon
Activités enzymatique
caractéristiques
· (+) : Catalase, Uréase,
réduction de nitrate en nitrite, Hippurate
· (-) : Hydrolyse gélatine,
hydrolyse caséine, Esculine
Tab II.1. Caractères
générales de C. glutamicum d'après Collins et
Cummins, (1986)
Chapitre II Materiels et Méthodes
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II.3.Conditions de culture II.3.1. Milieu de
préculture
Le milieu utilisé comme un milieu de base pour la
croissance de C. glutamicum est le BMCG (Basal Medium
Corynebacterium Growth). Les éléments qui composent ce
milieu sont donnés dans le tableau suivant
Tab. II.2. Composition de milieu BMCG
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Eléments
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Pré-culture (g/l)
|
|
Mg SO4
|
0,40
|
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Fe SO4
|
0,040
|
|
Fe Cl3
|
0.004
|
|
Zn SO4
|
0,001
|
|
Cu Cl2
|
0,0004
|
|
Mn SO4
|
0,004
|
|
Na2 HPO4
|
15,00
|
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KH2PO4
|
3,00
|
|
Na Cl
|
1,00
|
|
(NH4)2 SO4
|
8,00
|
|
Glucose
|
34,00
|
|
Urée
|
4.00
|
|
Thiamine
|
0,01
|
|
Biotine
|
0.0002
|
|
Ca Cl2
|
0,084
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Chapitre II Materiels et Méthodes
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II.3.2. Milieu de production
Le milieu BMCG à été remplacé par
un milieu naturel contenant de l'hydrolysat de son de blé. Le milieu est
ensuite enrichi par des sources d'azote (sulfate d'ammonium et urée),
des vitamines (biotine et thiamine) et des sels minéraux.
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