II.3.3.Stérilisation
La stérilisation des solutions est
réalisée par autoclavage ou par filtration. L'Erlenmeyer dans
lequel se déroule la fermentation est stérilisé à
l'autoclave avec le milieu de production. La stérilisation est
effectuée à 121°C pendant 15 minutes. Pour éviter les
réactions de brunissement non enzymatique, l'hydrolysat de son de
blé et les solutions supplémentaires (sources d'azote et sels
minéraux) sont stérilisés séparément. Les
solutions de vitamines sont stérilisées par filtration sur
filtres Minisart (0.2um).
? L'hydrolyse de son de blé
Le son de blé est tout d'abord broyé
mécaniquement jusqu'à obtention de fragments de taille
inférieure à 2 mm, puis macéré dans l'acide
sulfurique pendant 14 heurs. Le mélange est ensuit chauffé dans
un bain marrie agité. L'extrait obtenu est centrifugé à
4000 rpm pendant 20 minutes dans le but de séparer les débris
cellulosiques. Le surnageant récupéré est utilisé
en tant que source de carbone après être neutraliser (pH 7,6). Les
paramètres d'hydrolyse (concentration d'acide sulfurique, la
température d'hydrolyse et le temps) sont à optimisés.
II.4. Procédé de culture
discontinue II.4.1.Conservation de la souche
La conservation de la souche est réalisée sur
milieu à base de glycérol (glycérol stock). Une culture de
la souche C. glutamicum 2262 est effectuée en milieu liquide
BMCG. Après atteindre la phase exponentielle de la bactérie, le
glycérol stérile est ajouté à raison de 20%. La
suspension bactérienne est ensuite répartie dans des tubes
stériles (1 ml) puis congelée à - 20°C.
II.4.2.Propagation de la souche (préculture)
Les cultures stocks sont décongelées au fur et
à mesure des besoins, puis utilisées. Le tube de conservation
sert à inoculer le milieu de préculture. La préculture est
prise à l'ensemencement en phase exponentielle de croissance (14
heures).
Chapitre II Materiels et Méthodes
26
i ii iii
Fig.II.1. Propagation de C. glutamicum
2262
i-Tube de conservation à -20°C
ii-Préculture (milieu BMCG ,33°C ,14
heurs, 330 rpm) iii-Culture en Erlenmeyer (milieu de
production) II.4.3.Culture en Erlenmeyers
Après l'ajustement de pH à 7,6, le milieu de
culture est réparti dans des Erlenmeyers de 500 ml à un volume de
100 ml. Puis ils sont stérilisés à 121°C pendant 15
minutes. Le milieu de culture est inoculé par la préculture
à raison de 10% (v/v), ensuit incubé à 33°C sous
agitation de 330 rpm dans un incubateur New Brunswick Scientific. (Figure
II.2). Les cultures sont initiées à 33°C jusqu'au l'atteint
de la phase exponentielle de croissance (d'environ 5 heurs) puis un choc
thermique est réalisé à 39°C dans le but d'induire la
production du glutamate.
Fig .II.2. Incubateur New Brunswick
Scientific
II.4.3.1.Protocole des fermentations discontinues
Le volume final de réaction est fixé à
100 ml. L'inoculum est de 10%. Les conditions de culture sont :
? pH ajusté à 7,6
? Température de croissance : 33°C
Chapitre II Materiels et Méthodes
27
? Agitation : 330 rpm
? Température d'induction : 39°C
? Temps d'induction : 5h
? Les prélèvements sont effectués au
cours de la fermentation. La densité optique est lue
immédiatement et le reste de l'échantillon est centrifugé.
Le surnageant est récupéré puis congelé à
-20°C, les différents dosages étant réalisés
ultérieurement.
II.5. Méthode d'analyses
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