II.2.1.2.2. Procédure
de dosage
Une plaque (9F80-01) de 96 cupules, recouverte d'anticorps
monoclonaux de souris dirigés contre l'Ag HBs, est utilisée pour
ce dosage. (33)
Vingt-cinq microlitres (25ìL) de diluant pour
échantillon sont ajoutés dans chaque cupule. Ce diluant est un
tampon vert/brun avec des détergents et des protéines de
chèvre et de boeuf. Après addition de l'échantillon ou du
contrôle, cette couleur vire au bleu/vert, ce changement de coloration
peut varier d'un échantillon à l'autre mais doit toujours
être visible.
Ensuite, 75ìL d'échantillon à tester ou
de contrôle sont ajoutés dans les cupules. Le contrôle
négatif est un sérum humain normal, alors que le positif est un
sérum humain inactivé. Chacun des deux sérums est
dilué dans du tampon contenant des protéines d'origine bovine.
Le contrôle négatif est déposé dans
les puits A1 et B1, et le positif dans le puits C1. L'ajout des contrôles
dans les puits indiqués sur chaque plaque se fait après avoir
distribué les échantillons à tester. L'utilisation d'un
fond blanc est utile pour visualiser l'addition des échantillons. Ces
derniers doivent être soigneusement homogénéisés
avec le diluant pour échantillon.
La plaque est ensuite recouverte d'un couvercle et
incubée pendant 1 heure à 37°C dans des conditions
d'humidité.
A la fin du temps d'incubation on ajoute immédiatement
dans chaque puit 50ìL de conjugué. Ce dernier est de couleur
brune, il contient des AC (monoclonaux de chèvre) lyophilisés,
marqués à la peroxydase de raifort dans une base protéique
bovine.
Après incubation de la plaque, recouverte, pendant
30min à 37°C dans des conditions d'humidité, cette
dernière est lavée, automatiquement, par un liquide de lavage
qu'on prépare par la dilution de la Glycine/Borate au 1/20 à
l'eau distillée. Ce système automatique est programmé sur
5 cycles de lavage, le rôle de ce dernier est d'éliminer tous les
éléments non fixés. (33)
Après lavage de la plaque, 100ìL de solution
substrat sont immédiatement ajoutés dans chaque cupule. Cette
solution est préparée par l'ajout d'un volume de diluant du
substrat incolore à un volume égal de concentré de
substrat rose contenant de la 3,3', 5,5'- tétraméthylbenzidine
« TMB »et des stabilisants. La solution substrat devient pourpre au
contact les puits positifs.
La dernière incubation de la plaque se fait pendant 30
min à l'abri de la lumière. Une couleur pourpre proportionnelle
à la quantité d'AC devrait apparaître dans des puits
contenant des échantillons positifs.
Cinquante microlitres (50ìL) de solution d'arrêt
(acide sulfurique) sont ajoutés dans chaque cupule. Enfin, la lecture de
la densité optique est effectuée dans les 15 min à la
longueur d'onde 450nm. (33)
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