Memoire Online - Caractérisation moléculaire des bactéries lactiques des levains de panification

L'observation microscopique est nécessaire pour définir la forme des cellules bactériennes (coques ou bacilles). La coloration de Gram des isolats après 72 h de culture sur MRS modifié permet de s'assurer que nous sommes effectivement en présence des bactéries gram positive (coloration violette).

La catalase est une enzyme contenant du fer, elle catalyse la décomposition du peroxyde d'hydrogène en eau et en oxygène. Le test de détection de cette enzyme dans une souche bactérienne, consiste à ajouter du peroxyde d'hydrogène aux cellules bactériennes, la présence de la catalase se marque par la formation des bulles de gaz (oxygène).

La souche est cultivée dans un bouillon MRS modifié en bouillon. Le dégagement du gaz carbonique retenu par la cloche de Durham met en évidence le caractère hétérofermentaire.

1 ml de la culture bactérienne en phase exponentielle de croissance est centrifugé à 7500 rpm pendant 10 minutes. Après avoir éliminé le surnageant, le culot bactérien est resuspendu avec 180ul de tampon de lyse (20mM Tris-HCl pH 8 ; 2mM EDTA ; 1,2% Triton X-100 ; 20 mg/ml lysozyme) suivi d'une incubation à 37°C pendant une heure. 25ul de protéinase K et 200ul de tampon AL sont ajoutés pour dégrader toutes les protéines après une incubation à 70°C pendant 30 minutes. Cette étape est suivie par l'addition de 200 ul d'éthanol absolu. Le mélange est ensuite transvasé sur une colonne, puis centrifugé à 8000 rpm pendant une minute. L'éluant est éliminé et l'ADN est récupéré sur une colonne dans un tube de 2 ml à lequel on ajoute 500 ul de tampon AW1. On centrifuge à 800rpm pendant une minute et on jette l'éluant et le tube. De nouveau, l'ADN est récupéré dans un tube de 2 ml à lequel on ajoute 500 ul de tampon AW2. On centrifuge à 15 000 rpm pendant 3 minutes et on jette l'éluant et le tube. On place la colonne sur un tube de 1,5ml et on ajoute cette fois-ci 100 ul de tampon AE directement sur la membrane. On incube à température ambiante pendant une minute et on centrifuge à 8 000 rpm pendant une minute. Cette démarche est renouvelée puis, on jette la colonne et on conserve l'ADN pur extrait à -20°C.

Le but est d'obtenir une concentration d'ADN entre 20 et 100 ng/ul pour chaque échantillon avant de réaliser le PCR. La quantification se fera grâce au spectrophotomètre UVIKON BIOTEK. La concentration d'ADN sera calculée selon la formule suivante:

Les amorces oligonucléotidiques utilisées dans cette étude sont obtenues d'Invitrogen

Code	Localisation	Séquences oligonucléotidiques Primers (5'?3')	T (°C) Hybridation	*Références*
16S/2	16S 1389-1407 de E.coli	CTT GTA CAC ACC GCC CGT C	60°C	Gürttler et Stanisich 1996
23S/10	23S ARNr 456-474 de E.coli	CCT TTC CCT CAC GT ACT G	60°C	Idem
23S/7	23S ARNr 188-208 de E.coli	GGT ACT TAG ATG TTT CAG TTC	60°C	Idem
ARNt^ala	ITS	TAG CTC AGC TGG GAG AGC	60°C	Idem
Ls1		AAGTCGCCCAATTGATTCTTAGT	65°C	Zapparoli et al., 1997
Ls2		TTCACCCTAATCATCTGTCCCA	65°C	Zapparoli et al., 1997
TGGE (L1401)	V6-V8	GCG TGT GTA CAA GAC CC	56°C	Zoetendal et al., 1998
*TGGE* *(U968-GC)*	V6-V8	CGC CCG GGG CGC GCC GGG GAA CGC GAA GAA CCT TAC	56°C	Vasquez et al., 2001 Zoetendal et al., 1998

Le mélange final pour les réactions de PCR a un volume de 25 ul et contient 1x PCR Mix du tampon Taq polymérase sans MgCl_2, 2,5 mM MgCl₂(Biolabs, New England), 1uM pour chaque amorce (Invitrogen), 0,25 mM pour chaque dNTP (Eurogentec), 1U de Taq polymérase (Biolabs, New England) et 20-50ng/ml d'ADN. La réaction du PCR s'effectue dans le thermocycleur PTC-100 (MJ Research Inc., Watertown MA, USA). L'amplification des ISRs comprend 35 cycles : 1 minute de dénaturation à 94°C, 1 minute d'annealing ou d'hybridation à 60°C et 1 minute d'extension à 72°C.

La composition du mélange PCR et les conditions d'amplifications sont les mêmes que celles qui sont décrites ci-dessus. Cette deuxième réaction d'amplification est faite après l'obtention des résultats de la première amplification (présence de 2 ou 3 fragments).

La composition du mix PCR est la même que précédemment. L'amplification des ISRs comprend 35 cycles avec un changement au niveau de la température d'hybridation des amorces qui est de 65°C.

C'est une méthode rapide et efficace pour la détection et l'identification de la population des levains de panification. Des colonies de diamètre compris entre 1-1,5 mm ont été choisies et mélangées avec 5 ul de l'eau stérile. Cette suspension sera incubée 5 minutes à 95°C. On centrifuge à l'aide d'une micro-centrifugeuse et 1-3,5 ul sont utilisés pour la réaction de PCR. Les conditions d'amplifications sont les mêmes que celles qui sont décrites plus loin et la composition du mélange PCR reste le même à laquelle on ajoute 0,1 x BSA.

Les molécules placées dans un champ électrique migrent vers l'anode. Dans le gel, la mobilité électrophorétique dépend de la taille des molécules et de leur conformation. Les molécules de forme linéaire migrent d'autant plus vite qu'elles sont de petites tailles. Les produits d'amplifications seront séparés sur un gel d'électrophorèse à 1,5% d'agarose dans une solution tampon TAE colorée au BET. La migration se fait sous un voltage de 100V. L'observation de chaque gel se fera sur le transilluminateur à UV grâce à la fluorescence sous UV du complexe ADN-UV. Afin de déterminer la taille de chaque fragment, le marqueur de poids moléculaire 100 pb DNA ladder sera utilisé.

Les produits du PCR avec les primers tRNA^ala- 23S/10 sont digérés par des enzymes de restriction. Les enzymes utilisées sont : HindIII, HinfI et áTaqI (Biolabs). La réaction de enzymatique se réalise avec un volume final de 20 ul contenant 1x du tampon 0,1 x BSA, 10U de l'enzyme et 16 ul du produit du PCR. Les produits de digestion sont séparés sur un gel d'électrophorèse dans 2% (wt/vol) agarose-résophore dans le TBE comme tampon (1x). Les gels sont colorés par 0,5 ug/ml de BET et visualisés sous UV. Les photographies sont prises par une vidéo caméra (Sony, Clichy, France) et sauvegardés. Ils seront analysés par le logiciel Bio Profile 1D⁺⁺(Vilbert Lourmat, Marne La Vallée, France).

L'extraction de l'ADN total bactérien est décrit par Meroth et al., (2002) avec des petites modifications. 10g de levain sont homogénéisés pour 5 minutes par un stomacher dans un sac contenant 90 ml d'une solution de tryptone-sel. Un aliquote (50 ml) est centrifugé à 4°C pour 5 minutes à 100 rpm. Le surnageant est centrifugé pour 15 minutes à 4000 rpm et le culot cellulaire est stocké à -20°C. Le culot est ensuite déposé sur glace et lavé 3 fois par 1 ml d'une solution tampon de phosphate saline et une fois par 1 ml de l'eau. Puis on le resuspend dans 130 ul d'un tapon lyse ( 6 ,5% sucrose, 50mM Tris HCl pH 8, 0,1 mM EDTA, 20 mg/ml lysozyme et 100ug/ml RNase). Après une incubation d'une heure à 37°C, on ajoute 30 ul du NaCl (5M) et le tout est incubé pour 10 minutes à 65°C. Ensuite, on ajoute successivement 20 ul de protéinase K (15mg/ml) et 10 ul de sodium dodécyle sulfate (20%). Le nouveau mélange est incubé pendant 30 minutes à 60°C. Enfin, 200 ul de phénol (65°C, pH =7) ont été ajoutés à la mixture et incubée pour 6 minutes à 60°C. Après le refroidissement sur glace, on procède 2 fois à l'extraction et avec des volumes égales de phénol-chloroforme-isoamyl alcool (25 :24 :1) et 2 fois par du chloroforme. Après la précipitation par de l'éthanol, l'ADN est gardé dans 100ul de Tris-HCl (10 mM, pH =8).

La PCR-TTGE est obtenue en utilisant les deux primers amplifiant les régions variables V6-V8 du gène ARNr. La PCR est effectuée dans un volume total de 50 ul contenant 1x tampon PCR sans le chlorure de magnésium, 2,5 mM MgCl_2,1 ug/ml ADN, 0,3 uM pou chaque primer, 0,25 mM dNTP et 1U de Taq polymérase. On a les mêmes conditions des PCR précédentes. Les produits du PCR sont séparés sur 1,5 % (wt/vol) du gel d'agarose (Eurobio, France) et consécutivement visualisés sous la lumière UV après une coloration par le BET.

10 ul du produit amplifié par PCR sont analysés par la TTGE sur le gel du polyacrylamide (composition et préparation dans l'Annexe 1). L'analyse du TTGE est effectuée en utilisant DCode Universal Mutation Detection System (Bio Rad, Marnes la coquette, France). Le gel du polyacrylamide 16 cm/16cm/1 mm est utilisé avec le tampon 1x TAE (2M tris base, 1M acide acétique glacial, 50mM EDTA). Les gels ont été préparés avec 11 % (wt/vol) de la solution d'acrylamide (acrylamide-bisacrylamide ; 37,5 :1) et une concentration d'urée finale de 9,7M. Pour séparer les bactéries étudiées, les conditions suivantes ont été admises : voltage -55V, température initiale -65,5°C, température finale - 70,5°C, gradient de température 0,2°C/h et le temps de migration est de 18 heures. 10 ul du produit de PCR sont introduites dans les pores. En outre, le gel est coloré pour 15 minutes par le colorant SYBR Green I

(Molecular Probes, Eugene OR, USA) et photographié sur la table disposant d'un transilluminateur à UV.

L'objectif de cette étude est de montrer l'influence de la matière première mise en oeuvre sur la flore lactique d'un levain et notamment sur la diversité des espèces du genre Lactobacillus. Pour cela deux échantillons de levains ont été analysés : BF -70 entretenu sur farine de type 70, et BF-FC rafraîchi sur farine de blé concassé.

L'acidité plus élevée du levain BF-FC peut-être mise en relation avec le taux de cendres supérieur et la quantité plus importante de parties périphériques du grain dans le cas du blé concassé.

Les dénombrements sont effectués sur les milieux MRS modifié agar et SDB agar pour les bactéries lactiques et sur le milieu Sabouraud glucose agar avec chloramphénicol pour la flore levurienne (Tableau n°6).

Tableau n°6: Dénombrement des levures et des bactéries lactiques dans les levains BF

Echantillons	Bactéries lactiques		Levures
	MRS m UFC/g	SDB UFC/g	Sabouraud glucose agar UFC/g
BF-70	1,4.10⁹	5,1.10⁹	1,5 .10⁸
BF-FC	1,9.10⁹	3,1.10⁹	1,5.10⁸

La population bactérienne observée sur SDB agar est plus importante que sur MRS modifié agar. Les colonies sont plus petites sur SDB agar et elles présentent pratiquement la même morphologie. Les populations obtenues ne présentent pas de différences significatives entre les deux levains analysés.

Selon les analyses antérieures sur ce levain, Lb. sanfranciscensis est la flore lactique dominante du levain BF. Le milieu SDB, de part sa composition (pH qui vaut 5,6 et présence d'extrait frais de levure) est favorable à la croissance et au dénombrement cette espèce bactérienne (Kline et Sugihara, 1971). A l'inverse, le milieu MRS m est moins favorable et ne permet pas le dénombrement de la totalité des flores présentes dans le levain.

Les étapes d'identification consistent à réaliser les différents tests phénotypiques comme la coloration de Gram, le test catalase et le test homo-hétérofermentaire.

A partir du milieu MRS m, 20 isolats de chaque échantillon ont été purifiés et soumis à la coloration de Gram et au test catalase. Les 20 isolats provenant de la farine BF-70 sont des bacilles Gram positifs, catalases négatives, 18 sont hétérofermentaires et 2 homofermentaires. Sur la farine concassée, le même travail a été entrepris. Les 20 isolats obtenus sont des bacilles Gram positif, catalase négative et tous sont hétérofermentaires.

L'amplification par PCR avec les amorces 16S/2-23S/7 des 16 isolats hétérofermentaires du BF-70 montre un profil de 3 bandes sur le gel d'agarose. Ce profil correspond à l'espèce Lb. sanfranciscensis type de notre étude. En effet selon Valcheva et al., 2006 la présence de ces 3 fragments est uniquement observée chez Lb. sanfranciscensis alors que toutes les autres espèces de Lactobacillus présentent seulement 2 types d'opérons ribosomiques.

l'amplification des souches de référence utilisées dans cette étude : 1-Lb.

paralimentarius, 2- Lb.spicheri,3-Lb. kimchii, 4-Lb. sanfranciscensis ATCC

Après avoir déterminé de manière probable l'espèce qui domine dans l'échantillon BF-70, nous avons confirmé ce résultat en procédant à l'amplification de la région tRNA^ala-23S/10 par les amorces correspondantes à cette séquence nucléique dans le but de faire ensuite la restriction enzymatique .On observe donc la présence d'un seul fragment d'amplification sur la figure n°8 :

Figure n°8: Amplification par les amorces tRNA^ala-23S/10 (souches : 1,8 et 16)

On observe ainsi que toutes les souches présentent un seul fragment de taille identique de 740 pb environ. L'étape suivante va consister à générer des profils de restriction en utilisant des enzymes permettant de différencier Lb. sanfranciscensis. Les 3 enzymes choisis dans notre étude sont : Hind III, Hinf I et á Taq I.

Pour tous les isolats il génère le même profil connu et caractéristique pour Lb. sanfranciscensis ATCC 44322.

Seul l'enzyme á Taq I donne un profil unique pour cette souche de Lb. sanfranciscensis ATCC 43322. Les tailles des fragments digérés par l'enzyme á Taq I sont les suivantes : 110,140, 160, 310 et 380 pb.

Les autres enzymes génèrent des profils communs à Lb. paralimentarius DSM13238, Lb. alimentarius CIP 102986^T et Lb. delbrueckii subsp. delbrueckii DSM 20074. Les tailles des fragments des fragments digérés par Hinf I sont : 60, 210 et 470 pb et par Hind III sont : 320 et 420 pb.

La taille des fragments a été obtenue à l'aide du logiciel Bio Profile 1D⁺⁺(Vilbert Lourmat). Lors de cette étude, nous avons pris les valeurs moyennes arrondies de tous les essais par souche et par enzyme de restriction. L'intervalle de confiance estimé à environ 7% pour chaque fragment à l'aide du logiciel Bio 1D⁺⁺.

Pour la confirmation finale des résultats on a choisi de faire la PCR avec des primers spécifiques de Lb. sanfranciscensis (Zapparoli et al., 1997) sur les isolats. Elle permet l'identification définitive de Lb. sanfranciscensis ATCC 43322 pour les isolats étudiés comme le montre la figure n°10 où on oberve un seul fragment de 1460 pb spécifique de cette espèce (Zapparoli et al., 1997) .

On a procédé tout d'abord à l'amplification de la région ITS par les amorces 16S/2-23S/7. Sur 20 isolats, seules 12 souches ont été amplifiées. Les isolats proviennent du milieu MRS modifié.

On recueille un profil de 3 bandes pour toutes les souches étudiées (figure n°11). Lb. sanfranciscensis représenterait encore une fois 100% de la flore lactique de la farine concassée. On procède aux mêmes démarches que celles utilisées pour l'étude de la flore lactique de BF-70.

Après une amplification de la région tRNA^ala-23S/10 et une restriction enzymatique par les enzymes de restriction utilisés pour les isolats du BF-70, on observe sur la figure n°12 pour l'isolat M9 choisi comme exemple que celui-ci comme les autres isolats de ce levain présente un profil de restriction identique à celui de Lb. sanfranciscensis ATCC 44322. .

Figure n°12: PCR t^ala/10 et RFLP par Hinf I, Hind III et á Taq I de l'isolat M9

En outre, pour confirmer que les isolats appartiennent à l'espèce Lb. sanfranciscensis, une PCR avec les amorces spécifiques a été faite. La figure n°13 ci-dessous montre le résultat d'amplification des 3 isolats avec les amorces spécifiques.

Figure n°13 : PCR avec primers spécifiques de l'espèce Lb. sanfranciscensis ATCC 43322

Les approches classiques pour la caractérisation et l'identification des bactéries lactiques des levains prennent beaucoup de travail et du temps.

Dans cette étude, nous avons essayé de développer la PCR sur colonie comme méthode pour la détection rapide de la population des bactéries lactiques. Différents protocoles avec différentes modifications ont été employés. Les petites colonies ont été sélectionnées et inoculées dans 5 ul de l'eau stérile. Ensuite elles seront incubées pendant 5 minutes à 95°C et 2 à 3 ul de la suspension est utilisée pour y être amplifiée. Des modifications au niveau du mix PCR ont été faites.

Cette méthode permet de détecter rapidement la population et le pourcentage de Lb. sanfranciscensis dans l`échantillon de levains. Dans notre cas, la PCR sur colonies a confirmé que ces isolats provenant des deux échantillons appartenaient à l'espèce Lb. sanfranciscensis.

Cette technique est choisie pour étudier le suivi dynamique des communautés bactériennes. Ainsi, chaque communauté est représentée par un profil où chaque bande électrophorétique correspond à une espèce définie. L'identification des espèces se fait grâce à un référentiel préalablement établi à partir de fragments d'ADN de souches pures.

L'extraction d'ADN bactérien est effectuée directement de la matrice à analyser. Dans notre cas on a choisi à amplifier la région V6-V8 du 16S rDNA des deux échantillons.

Le gel ci-dessus montre le profil des échantillons BF. Les fragments correspondent 100 % à Lb. sanfranciscensis ATCC 44322.

Il faut noter que la TTGE ne permet pas d'identifier les populations sous-dominantes, qui peuvent avoir un intérêt.

Ce projet avait pour objectifs : d'une part de montrer l'influence de la matière première mise en oeuvre sur la flore lactique d'un levain et notamment sur la diversité des espèces de Lactobacillus et d'autre part de valider les méthodes moléculaires de caractérisation des flores lactiques. Les principaux résultats obtenus sont les suivants :

- Les populations obtenues ne présentent pas de différences significatives entre les deux levains analysés.

- Les 20 isolats provenant de la farine BF-70 sont des Lactobacillus, 18 d'entre eux sont hétérofermentaires et 2 homofermentaires. Sur la farine concassée, les 20 isolats obtenus sont des Lactobacillus hétérofermentaires.

- L'amplification par PCR avec les amorces 16S/2-23S/7 a mis en évidence la présence de 3 fragments d'amplification et a conduit à l'identfication présumée de Lb. sanfranciscensis pour les 16 isolats hétérofermentaires du BF-70 et les 12 isolats BF-FC .

- L'étape suivante (RFLP) consistant à générer des profils de restriction en utilisant des enzymes Hind III, Hinf I et á Taq I a permis d'identifier spécifiquement Lb. sanfranciscensis et l'enzyme Taq I s'est révélée être la plus discriminante.

- Enfin l'utilisation des des primers spécifiques de Lb. sanfranciscensis (Zapparoli et al., 1997) a permis de conclure que tous les isolats hétérofermentaires appartenaient à l'espèce Lb. sanfranciscensis .

En conclusion, dans les levains de panification réalisées à partir de la farine concassée, la flore lactique semble être constituée uniquement de l'espèce Lb. sanfranciscensis alors que la biodiversité bactérienne semble être plus importante dans les levains fabriqués à partir de la farine BF-70 (une faible pourcentage de lactobacillus homofermentaires).

? Compléter l'étude de la biodiversité des flores lactiques des levains français de panification en identifiant les espèces de bactéries non encore identifiées par d'autres méthodes moléculaires telles que la PCR multiplex et la RAPD.

? Valider les méthodes moléculaires de caractérisation et de détection des flores céréaliers par PCR-RFLP et PCR spécifiques sur les régions intergéniques 16S-23S sur un échantillon plus large de levains et constituer une banque de profils avec les souches de référence et les souches sauvages des levains.

? Contribuer à une meilleure connaissance de la dynamique des écosystèmes par des méthodes moléculaires cultures indépendantes comme la TTGE.

? Utiliser des souches pour reconstituer des levains pour obtenir des propriétés technologiques et nutritionnelles intéressantes.

? Analyser quantitativement les populations bactériennes par des méthodes moléculaires comme la PCR quantitative (Real Time PCR).

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Tableau n°2: Exemples de quelques enzymes de restriction et leurs sites de reconnaissances

Tableau n°6: Dénombrement des levures et des bactéries lactiques dans les levains BF 16

Tableau n°7: Ratio des isolats homo/hétérofermentaires dans les levains 17

Figure n°1 : Positions des régions conservées de l'opéron ribosomique 16S-23S chez

Figure n°2 : Organisation de la région intergénique 16S-23S de l'ARNr chez les bactéries

Figure n°4 : Formation d'un brin d'ADN ramifié grâce à la présence de GC clamp 9

Figure n°8 : Amplification par les amorces tRNA^ala-23S/10 (souches : 1,8 et 16) 19

Figure n°12 : PCR t^ala/10 et RFLP par Hinf I, Hind III et á Taq I de la souche M9 21

Figure n°13 : PCR avec primers spécifiques de l'espèce Lb. sanfranciscensis

Caractérisation moléculaire des bactéries lactiques des levains de panification

VI. Caractérisation des bactéries lactiques

CONCLUSION

PERSPECTIVES

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

TABLEAUX ET FIGURES