Caractérisation moléculaire des bactéries lactiques des levains de panification

ANNEXE I

Les milieux de culture

1. MRS (Man Sharpe Rogosa) modifié: Biokar diagnostics

La composition en gramme par litre est la suivante :

Composés		Quantité (g)
polypetone		10
Extrait de viande		10
Extrait autolytique de levure		5
Glucose		20
Tween 80		1,08
Phosphate dipotassique		2
Acétate de sodium		5
Citrate d'ammonium		2
Sulfate de magnésium		0,2
Sulfate de manganèse		0,05
Agar		15
pH à 25°C= 6,5+/-0,2

55,3 g du milieu est mélangé avec : 10 g/l de maltose, 5 g/l de fructose, 0,5 g/l de cystéine et 5 ml de FYE et mis en suspension dans un litre d'eau distillée, ensuite chauffé sous agitation magnétique jusqu'à homogénéisation complète. Stériliser à l'autoclave à 121°C pendant 15 minutes. Le milieu est coulé dans des boîtes de pétri à 45°C en milieu stérile.

Le bouillon MRS modifié (55g/l) a la même composition sauf qu'il ne contient pas de l'agar biologique.

2. SDB (SourDough Bacteria) : Kline et Sugihara, 1971

La composition en gramme par litre est la suivante :

Composés	Quantité (g)
Maltose	20
Extrait de levures	3
FYE	0,5% (v/v)
Tween 80	3ml de 10% solution par litre
Peptone de soja	12
Agar	15
pH à 25°C= 5,6

Le bouillon SDB a la même composition sans l'agar biologique.

3. Tryptone sel

Ce milieu contient 2 g de peptone et 17 g de chlorure de sodium. La solution est répartie dans des tubes de 9 ml avant d'être stérilisée à 121°C pendant 15 minutes et stockée à 4°C. Cette solution sert pour les dilutions.

4. Préparation du FYE :

20% de suspension commerciale de levure boulangère est mélangée dans de l'eau distillée. Le mélange est stérilisé pendant 30 minutes à 121°C. Après une nuit de repos et de décantation entre 2 et 8°C, le mélange est ensuite centrifugé. Le surnageant est récupéré et stocké à -20°C.

5. Sabouraud glucose agar + Chloramphénicol :

La composition en gramme par litre est la suivante :

Composés	Quantité (g)
Peptone pepsique de viande	10
Glucose	35
Chloramphénicol	0,5
Agar agar biologique	15

pH à 25°C : 5,7 +/-0,2

60g/l sont mis en suspension dans un litre d'eau distillée. Le mélange st chauffé lentement sous agitation magnétique jusqu'à la dissolution complète. Stériliser à l'autoclave à 121°C pendant 15 minutes.

6. La préparation du gel d'Agarose :

On mélange 50% d'agarose-réosphore (référence 018649 Eurobio) et 50% d'agar standard (référence 018054 Eurobio). On ajoute 100 ml du tampon TBE sur la mixture ci-dessus.

On vérifie que l'agarose est complètement dissous et on ajoute 15 ul de BET pour la coloration.

7. La préparation du gel d'acrylamide :

La composition du gel est la suivante :

12,6 g d'urée dans 14,5 ml d'eau (mélange à 45°C), 1ml d'ammonium persulfate, 6ml d'acrylamide, 750ul du tampon TAE 50x, 27,5ul d'une solution TEMEO et 275 ul d'APS à 10%. Le gel demande 2 heures pour y être polymérisé.

8. La préparation du colorant SYBR Green I :

On mélange 30 ul du colorant SYBR Green avec 300 ul d'une solution tampon TBE 1X.

9. La préparation du PCR mix :

Composition	Concentration initiale	Concentration finale	Volume par réaction (ul)
H2 O			19 ,283
Solution tampon	10x	1x	2,5
dNTP	20mM	0,2mM	0,2
Amorce 1	100umole	1uM	0,225
Amorce 2	100umole	1uM	0,225
MgCl2	25mM	1,5mM	1,5
Taq polymérase	15U/ul	1U	0,067
ADN			1

- Taq ADN polymérase :

Marque : Q-Biogene ; Concentration : 2000U (15 U/ul)

- Solution Tampon : Incubation mix sans MgCl₂

Marque: Q-Biogene; Concentration: 10X

- MgCl₂ :

Marque: Q-Biogene; Concentration: 25mM

- dNTP Master Mix :

Marque: Eurogentec; Concentration: 20mM

- Oligonucléotides :

* 23S/10 : Concentration : 100uM

Marque : Eurobio

* tRNA^ala : Concentration : 100uM

Marque : Eurobio

? Programme du PCR

Dénaturation de l'ADN : 94°C pour 5minutes

35 cycles

Dénaturation 94°C pour 1minute

Hybridation 60°C 1minute

Elongation 72°C 1minute

Elongation terminale 72°C 5minutes

Refroidissement 4°C

10. RFLP mix :

Composition	Volume/réaction (ul)
	á Taq I	Hinf I	Hind III
H2 O	1,85	0,75	1,75
Spesific (10X)	2,5	2,5	2,5
BSA (0,1X)	0,25	0,25	0,25
Produit du PCR	20	20	20
Enzyme (10 U/réaction)	0,4	1	0,5

Les enzymes :

? á Taq I

Concentration : 20000U/ml

Contient : 0,2ml (5000U)

Marque : Biolabs

Tampon : Tampon Ne pour Taq I 10X Ref B0149S

Température d'incubation : 65°C pour 4 heures minimum

? Hinf I

Concentration: 10000U/ml

Contient: 0,5ml (5000U)

Marque: Biolabs Ref R0155S

Tampon: Tampon Ne 2 Biolabs 10X

Température d'incubation : 37°C pour 4 heures minimum

? Hind III

Concentration: 20000U/ml

Contient: 0,5ml (10000U)

Marque: Biolabs Ref R0104S

Tampon: Tampon Ne 2 Biolabs 10X

DENOMBREMENTS

BF-70

Milieux et dilutions Echantillon	Sabouraud glucose agar		MRS m agar		SDB agar
	10^-5	10^-6	10^-5	10^-6	10^-5	10^-6
BF-1	13,5	15	31	14	90	51
BF-2	61,5	9	119	13,5	173,5	45,5
BF-3	46,5	3,5	57,5	7,5	108,5	36

BF-FC

Milieux et dilutions Echantillon	Sabouraud glucose agar		MRS m agar		SDB agar
	10^-5	10^-6	10^-5	10^-6	10^-5	10^-6
BF-1	1,5	0	24	3	30	4,5
BF-2	5,5	0	59,5	18	90	28,5
BF-3	0	0	42	4	32,5	3,5
TESTS PHENOTYPIQUES

BF-70

Tests N° tubes	Morphologie et aspect des colonies	La coloration de Gram	Test au catalase	Test homo-hétérofermentaire
1	Colonies de petite taille (1-1,5 mm), blanches crémeuses, bombées, lisses et rondes.	+	-	Hétéro
2	idem	+	-	Hétéro
3	idem	+	-	Hétéro
4	idem	+	-	Hétéro
5	idem	+	-	Hétéro
6	idem	+	-	Hétéro
7	idem	+	-	Hétéro
8	idem	+	-	Hétéro
9	idem	+	-	Hétéro
10	idem	+	-	Hétéro
11	idem	+	-	Hétéro
12	idem	+	-	Hétéro
13	idem	+	-	Hétéro
14	idem	+	-	Hétéro
15	idem	+	-	Homo
16	idem	+	-	Hétéro
17	idem	+	-	Hétéro
18	idem	+	-	Hétéro
19	idem	+	-	Hétéro

BF-FC

Tests N° tubes		Morphologie et aspect des colonies			La coloration de Gram		Test au catalase		Test homo-hétérofermentaire
1		Colonies de petite taille (1-1,5 mm), blanches crémeuses, bombées, lisses et rondes.			+		-		Hétéro
2		idem			+		-		Hétéro
3		idem			+		-		Hétéro
4		idem			+		-		Hétéro
5		idem			+		-		Hétéro
6		idem			+		-		Hétéro
7		idem			+		-		Hétéro
8		idem			+		-		Hétéro
9		idem			+		-		Hétéro
10		idem			+		-		Hétéro
11		idem			+		-		Hétéro
12		idem			+		-		Hétéro
13		Grosses colonies			+		-		Hétéro
14		Colonies de petite taille (1-1,5 mm), blanches crémeuses, bombées, lisses et rondes.			+		-		Hétéro
15		idem			+		-		Hétéro
16		idem			+		-		Hétéro
17		idem			+		-		Hétéro
18		idem			+		-		Hétéro
19		Grosses colonies			+		-		Hétéro
20		idem			+		-		Hétéro
ENZYMES			SOURCE MICROBIENNE					SEQUENCE
Alu I			Arthrobacter luteus					? 5'-A-G-C-T-3' 3'-T-C-G-A-5'
Bam HI			Bacillus amyloliquefaciens H					? 5'-G-C-A-T-C-C-3' 3'-C-C-T-A-G-G-5' ?
Eco RI			Escherichia coli					? 5'-G-A-A-T-T-C-3' 3'-C-T-T-A-A-G-5' ?
Eco RII			Escherichia coli					? 5'-C-C-T-G-G-3' 3'-G-G-A-C-C-5' ?
Hae III			Hæmophilus ægyptius					? 5'-G-G-C-C-3' 3'-C-C-G-G-5' ?
Hind III			Hæmophilus influenzæ b					? 5'-A-A-G-C-T-T-3' 3'-T-T-C-G-A-A-5' ?
Hinf I			Hæmophilus influenzæ Rf					? 5'-G-A-N-T-C-3' 3'-C-T-N-A-G-5' ?
á TaqI								? 5'-T-C-G-A-3' 3'-A-G-C-T-5' ?
Code	Localisation			Séquences oligonucléotidiques Primers (5'?3')		T (°C) Hybridation				Références
16S/2	16S 1389-1407 de E.coli			CTT GTA CAC ACC GCC CGT C		60°C				Gürttler et Stanisich 1996 Kabadjova et al, 2002
23S/10	23S ARNr 456-474 de E.coli			CCT TTC CCT CAC GT ACT G		60°C				idem
23S/7	23S ARNr 188-208 de E.coli			GGT ACT TAG ATG TTT CAG TTC		60°C				idem
ARNt^ala	ITS			TAG CTC AGC TGG GAG AGC		60°C				idem
TTGE				GCG TGT GTA CAA GAC CC
TTGE				CGC CCG GGG CGC GCC GGG GAA CGC GAA GAA CCT TAC
Psfpar1	ITS			5' CTC TGT TAT ATT TGA ATA AGTACT 3'
psfspich	ITS			5' GAC CGC AAG GTC ATC ATT AT3'

L-ITS : Lb. paralimentarius

>437 pb

CTAAGGATATGGTACTTTGGTACCAACGGAAATACACAATTGTTAAAACTTTGTTTAGTTTTGAGGGGTCTACCTGGCGCTTTCGGGCCTATAGCTCAGCTGGTTTAGAGCGCACGCCTGATAAGCGTGAGGTCGATGGTTCAAGTCCATTTAGGCCCATTTTCTCTGTTATAATTGAATAAGTACTATGGGGGTTTAGCTCAGCTGGGAGAGCACCTGCTTTGCAAGCAGGAGGTCATCGGTTCGATCCCGTTAACCTCCATTGACAGAGATGTCATACTCGTACCTTGTAAACTGGATATTAAGGATTAATGAATTAAAGAAACACCGAAAACTGCGCGGCAATCTTTTTGATTGCCAGCTGTGACGAAAGTCATGGCAAATTGTTTTAAATTACTTTTTGTAATTTAATTTAGGTTAAGTTATAAAGGGCGCAC

Sequence tRNA Bounds tRNA Anti Intron Bounds Cove

Name tRNA # Begin End Type Codon Begin End Score

-------- ------ ---- ------ ---- ----- ----- ---- ------

, 1 85 159 Ile GAT 0 0 78.68

, 2 190 262 Ala TGC 0 0 65.92

S-ITS: Lb. paralimentarius 

>238 pb

CTAAGGATATGGTACTTTGGTACCAACGGAAATACACAATTGTTAAAACTTTGTTTAGTTTTGAGGGGTCTACCCTCAAACTCGTACCTTGAAAACTGGATATTAAGAATTAATGAATTAAAGAAACACCGAAAACTGCGCGGCAATCTTTTTGATTGCCAGCTGTGACGAAAGTCATGGCAAATTGTTTTAAATTACTTTTTGTAATTTAATTTAGGTTAAGTTATAAAGGGCGCAC

L-ISR : Lb. mindensis

>418 pb

CTAAGGAATATACGGAGGCTACACATACTTGTTGAAACAATGTTCAGTTT

TGAGGGGCTTACCTCTCAACTAAATGATTTTGGGCGTATAGCTCAGCTGG

TTTAGAGCGCACGCCTGATAAGCGTGAGGTCGATGGTTCGAGTCCATTTA

TGCCCATTGACCGCAAGGTCATCATTATGGGGAATTAGCTCAGATGGGAG

AGCACCTGCTTTGCAAGCAGGGGGTCAGCGGTTCGATCCCGCTATTCTCC

ATTGGCACGAGAGTGCCAAGGAATTTGTTCTTTGAAAACTAGATATTATC

AATTATTTTCCTTTAATTATTAAGATAATTAAACCGAGAAACAACTGCGT

ATTTTTGAGTTTTTTAATTAGTTTATCGCTAATACTCAATTAATTTGACG

ATCACGAAGTGACCGTTA

Sequence tRNA Bounds tRNA Anti Intron Bounds Cove

Name tRNA # Begin End Type Codon Begin End Score

-------- ------ ---- ------ ---- ----- ----- ---- ------

, 1 82 156 Ile GAT 0 0 78.13

, 2 179 251 Ala TGC 0 0 65.35

S-ISR: Lb. mindensis

>196 pb

>readseq.input(1), 370 bases, CB80CAB5 checksum.

CTAAGGATATGGTGCTTTAGCACCAACGGAAATACACAACGTTAAAACTTTGTTTAGTTTTGAGAGGTCTACTCTCAAACTCGTACCTTGAAAACTGGATATTAAGAATTAATGATTTAAAAGAAACACCGAAAACTGCGCGATAAAAGTGGATGTATTTCCATATTCTGTCAAGATTAAGTTATAAAGGGCGCAC

L-ISR : Lb. spicheri

>427 pb

CTAAGGAATAATACGGAGGCTACACATACTTTGTCGAAACAATGGTCAGT

TTTGAGGGGTCTACCCTCAAAGCCTTATGTGCTGTTTTGGGCGTATAGCT

CAGCTGGTTTAGAGCGCACGCCTGATAAGCGTGAGGTCGATGGTTCGAGT

CCATTTATGCCCATTGACCGTAAGGTCGATATG GGGAATTAGCTCAGATG

GGAGAGCACCTGCCTTGCAAGCAGGGGGTCAGCGGTTCGATCCCGCTATT

CTCCATTGGTGCGAGAGCATCAAGATAACTTGTTCTTTGAAAACTAGATA

TTATCAATTATTTTCCTTTAATTATTAAAGATAATTAAACCGAGAACACC

GCGTTTATTTTGAGTTTTTTAATTAGTTTTAAAATTCGCTAATACTCAAT

TAATCGTTCATCACGACGTGATGAATA

Sequence tRNA Bounds tRNA Anti Intron Bounds Cove

Name tRNA # Begin End Type Codon Begin End Score

-------- ------ ---- ------ ---- ----- ----- ---- ------

, 1 89 163 Ile GAT 0 0 78.13

, 2 183 255 Ala TGC 0 0 67.17

S-ISR : Lb. spicheri

>220 pb

CTAAGGAATAATACGGAGGCTACACATACTTTGTCGAAACAATGGTCAGTTTTGAGGGGTCTACCCTCAAACTTGTTCTTTGAAAACTAGATATTATCAATTATTTTCCTTTAATTATTAAAGATAATTAAACCGAGAACACCGCGTTTATTTTGAGTTTTTTAATTAGTTTTAAAATTCGCTAATACTCGATTAATCGTTCATCACGACGTGATGAATA

>434 pb

L-ISR: Lb. hammesii

CTAAGGAATATACGGAGGCTACACATACTTTGTCGAAACAATGGTCAGTT

TTGAGGGGTCTACCCTCATAATTATATGATTTTACTAAATGATTTTGGGC

GTATAGCTCAGCTGGTTTAGAGCGCACGCCTGATAAGCGTGAGGTCGATG

GTTCGAGTCCATTTATGCCCATTGACCGCAAGGTCATCATTTTGGGGAAT

TAGCTCAGATGGGAGAGCACCTGCTTTGCAAGCAGGGGGTCAGCGGTTCG

ATCCCGCTATTCTCCATTGGTGCGAAAGCATCAAGGAATTTGTTCTTTGA

AAACTAGATATTATCAATTATTTTCCTTTAATTATTAAGATAATTAAACC

GAGAAACAACTGCGTATTTTTGAGCTTTTTAATTAGTTTATATCGCTAAT

ACTCAATTAATCAGCGATTACGAAGTAATCGTTA

Sequence tRNA Bounds tRNA Anti Intron Bounds Cove

Name tRNA # Begin End Type Codon Begin End Score

-------- ------ ---- ------ ---- ----- ----- ---- ------

, 1 97 171 Ile GAT 0 0 81.21

, 2 194 266 Ala TGC 0 0 72.85

S-ISR: Lb. hammesii

>216 pb

CTAAGGAATATACGGAGGCTACACATACTTTGTCGAAACAATGGTCAGTTTTGAGAGGTCTACTCTCAAACTTGTTCTTTGAAAACTAGATATTATCAATTATTTTCCTTTAATTATTAAGATAATTAAACCGAGAAACAACTGCGTACTTTTGAGTTTTTTAATTAGTTTATATCGCTAATACTCAATTAATCAGCGATTACGAAGTAATCGTTA

S-ITS: Lb. Frumenti

>204 pb

CTAAGGAATAAAACGGAAACCTACACATAGTTGAAACTTTGTTTAGTTTTGAGGGGTTTACCCTCAGAGCTTGTACTTTGAAAACTAAATAATATCATTTTTCTTTATTTAACAAAACAAACCGAGAACACCGCGTTATTTTGAGTTGTTTAATGAAGATAATCGCTAACTCAATTAATCCGATGATCACTTAGTGATCATCAA

L-ITS: Lb. Frumenti

>397 pb

CTAAGGAATAAAACGGAAACCTACACATAGTTGAAACTTTGTTTAGTTTTGAGAGGTTTACTTCTCAAAACATCAGACGCTTATTTGGGCCTATAGCTCAGCTGGTTTAGAGCGCACGCCTGATAAGCGTGAGGTCGATGGTTCAAGTCCATTTAGGCCCATTATGGGGAATTAGCTCAGCTGGGAGAGCACCTGCTTTGCAAGCAGGAGGTCATCGGTTCGATTCCGTTATTCTCCATTGTCAACCGTGAGGTTGACAGAGCTTGTACTTTGAAAACTAAATAATATCATTTTTCTTTATTTAACAAAACAAACCGAGAACACCGCGTTATTTTGAGTTGTTTAATGAAAATAATCGCTAACTCAATTAATCCGATGATCACTTAGTGATCATCAA

Sequence tRNA Bounds tRNA Anti Intron Bounds Cove

Name tRNA # Begin End Type Codon Begin End Score

-------- ------ ---- ------ ---- ----- ----- ---- ------

, 1 87 161 Ile GAT 0 0 78.68

, 2 166 238 Ala TGC 0 0 66.64

L-ITS : Lb. panis

>405 pb

CTAAGGAATAAAACGGAACCTACACATCAGTTGAAACTTTGTTTAGTTTTGAGAGGTTTACCTTTCAAAACGTATGACGCTTATTTGGGCCTATAGCTCAGTTGGTTTAGAGCGCACGCCTGATAAGCGTGAGGCCGATGGTTCAAGTCCATTTAGGCCCATCATATTTTGGGGAATTAGCTCAGCTGGGAGAGCACCTGCTTTGCAAGCAGGAGGTCATCGGTTCGATTCCGTTATTCTCCATTGCTAGTCGTAAGATTAGCAGAGCTTGTACTTTGAAAACTAAATAATATCTAATTTCTTTATTTATTAAAACAATAAACCGAGAACACCGCGTTATTTGAGTTTTATTAACGAAATAATCGCTAACTCAATTAATCAAGGTGATCACTTCGTGATCATCAA

Sequence tRNA Bounds tRNA Anti Intron Bounds Cove

Name tRNA # Begin End Type Codon Begin End Score

-------- ------ ---- ------ ---- ----- ----- ---- ------

, 1 87 161 Ile GAT 0 0 77.04

, 2 171 243 Ala TGC 0 0 66.64

S-ITS: Lb. panis

>222 pb

ACTATAGGGAAAGCTCGGTACCACGCATGCTGCAGACGCGTTACGTATCGGATCCAGAATTCGTGATTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGAAGTTTGTAACGCCCAAAGTCGGTGGCCTAACCATTTGGAGGGAGCCGCCTAAGGCGGGACAGATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGAGAACCTGCGGCTGGATCACCTCCTTT

L-ITS: Lb. pontis

>403 pb

CTAAGGAATAAAACGGAGCCTACACATTGTCGAAACTTTGTTTAGTTTTGAGGGGTTTACCTCAAAACTTACTGAGACGCTTATTTGGGCCTATAGCTCAGCTGGTTTAGAGCGCACGCCTGATAAGCGTGAGGTCGATGGTTCAAGTCCATTTAGGCCCATATATGGGGAATTAGCTCAGCTGGGAGAGCACCTGCTTTGCAAGCAGGAGGTCATCGGTTCGATTCCGTTATTCTCCATTGCCAATCGTAAGGTTGGCACGAGCTTGTACTTTGAAAACTAAATAATATCTAATTTCTTTATTTATTAAAAACAATAAACCGAGAACACCGCGTTATTTGAGTTTTATTAACGAAATAATCGCTAACTCAATTAATTGAGATGACCACTAAGTGGTCATCAA

Sequence tRNA Bounds tRNA Anti Intron Bounds Cove

Name tRNA # Begin End Type Codon Begin End Score

-------- ------ ---- ------ ---- ----- ----- ---- ------

, 1 87 161 Ile GAT 0 0 78.68

, 2 167 239 Ala TGC 0 0 66.64

S-ISR: Lb. pontis

>207 pb

CTAAGGAATAAAACGGAACCTGCACATTGTCGAAACTTTGTATAGTTTTGAGGGGTTTACCCTCAGAGCTTGTACTTTGAAAACTAAATAATATCTAATTTCTTTATTTATTAAAAACAATAAACCGAGAACACCGCGTTATTTGAGTTTTATTAACGAAATAATCGCTAACTCAATTAATTGAGATGACCACTAAGTGGTCATCAA

L-ITS : Lb. nantensis AY690836

>389 pb

CTAAGGATATGATGCGTAAGCATCAACGGAAATACACAATTGTTAAAACTTTGTTTAGTTTTGAGAGGCCTACCGGGCGTTTTTCGGGCCTATAGCTCAGCTGGTTTAGAGCGCACGCCTGATAAGCGTGAGGTCGATGGTTCAAGTCCATTTAGGCCCATTCTCATATTAATAAGTACCATATGGGGGCTTAGCTCAGCTGGGAGAGCACCTGCTTTGCAAGCAGGAGGTCATCGGTTCGATCCCGTTAGCCTCCATTGACAGAAATGCCAATGTTCGTACCTTGAAAACTGGATATTAAGAAATAATGAATTAAAGAAACACCGAAAACTGCGCGATAAAAATGATTAATTTCATATTTTGTCAAGATTAAGTTATAAAGGGCGCAC

tRNA 86..160

tRNA 185..257

S-ITS : Lb. nantensis AY690835

>196 pb

CTAAGGATATGATGCGTAAGCATCAACGGAAATACACAATTGTTAAAACTTTGTTTAGTTTTGAGGGGTTTACCCTCAGTAACTCGTACCTTGAAAACTGGATATTAAGAAATAATGAATTAAAGAAACACCGAAAACTGCGCGATAAAAATGATTAATTTCATATTTTGTCAAGATTAAGTTATAAAGGGCGCAC

Pour alignement

>nantensis

CTAAGGATATGATGCGTAAGCATCAACGGAAATACACAATTGTTAAAACTTTGTTTAGTTTTGAGAGGCCTACCGGGCGTTTTTCGGGCCTATAGCTCAGCTGGTTTAGAGCGCACGCCTGATAAGCGTGAGGTCGATGGTTCAAGTCCATTTAGGCCCATTCTCATATTAATAAGTACCATATGGGGGCTTAGCTCAGCTGGGAGAGCACCTGCTTTGCAAGCAGGAGGTCATCGGTTCGATCCCGTTAGCCTCCATTGACAGAAATGCCAATGTTCGTACCTTGAAAACTGGATATTAAGAAATAATGAATTAAAGAAACACCGAAAACTGCGCGATAAAAATGATTAATTTCATATTTTGTCAAGATTAAGTTATAAAGGGCGCAC

>hammesii

CTAAGGAATATACGGAGGCTACACATACTTTGTCGAAACAATGGTCAGTT

TTGAGGGGTCTACCCTCATAATTATATGATTTTACTAAATGATTTTGGGC

GTATAGCTCAGCTGGTTTAGAGCGCACGCCTGATAAGCGTGAGGTCGATG

GTTCGAGTCCATTTATGCCCATTGACCGCAAGGTCATCATTTTGGGGAAT

TAGCTCAGATGGGAGAGCACCTGCTTTGCAAGCAGGGGGTCAGCGGTTCG

ATCCCGCTATTCTCCATTGGTGCGAAAGCATCAAGGAATTTGTTCTTTGA

AAACTAGATATTATCAATTATTTTCCTTTAATTATTAAGATAATTAAACC

GAGAAACAACTGCGTATTTTTGAGCTTTTTAATTAGTTTATATCGCTAAT

ACTCAATTAATCAGCGATTACGAAGTAATCGTTA

>spicheri

CTAAGGAATAATACGGAGGCTACACATACTTTGTCGAAACAATGGTCAGT

TTTGAGGGGTCTACCCTCAAAGCCTTATGTGCTGTTTTGGGCGTATAGCT

CAGCTGGTTTAGAGCGCACGCCTGATAAGCGTGAGGTCGATGGTTCGAGT

CCATTTATGCCCATTGACCGTAAGGTCGATATGGGGAATTAGCTCAGATG

GGAGAGCACCTGCCTTGCAAGCAGGGGGTCAGCGGTTCGATCCCGCTATT

CTCCATTGGTGCGAGAGCATCAAGATAACTTGTTCTTTGAAAACTAGATA

TTATCAATTATTTTCCTTTAATTATTAAAGATAATTAAACCGAGAACACC

GCGTTTATTTTGAGTTTTTTAATTAGTTTTAAAATTCGCTAATACTCAAT

TAATCGTTCATCACGACGTGATGAATA

RESUME

Les industries des produits céréaliers fermentés (panification, viennoiserie, crackers...) ont actuellement un regain d'intérêt pour les fermentations mixtes La maîtrise de ce procédé de fermentation mixte s'appuie d'une part sur l'étude de la biodiversité microbienne des levains et d'autre part sur la caractérisation des flores, notamment, lactiques à l'aide des outils biomoléculaires .L'objectif était d'étudier la biodiversité des flores lactiques des levains français de panification et l'influence du paramètre type de farine sur la flore lactique, ainsi que, la validation des méthodes moléculaires (PCR, PCR-RFLP) de caractérisation de ces flores.

Deux échantillons de levains français ont été analysés : un levain BF rafraîchi avec une farine de type 70 et un levain BF rafraîchi avec la farine du blé concassé. La flore lactique du levain de panification est constituée principalement de bactéries du genre Lactobacillus. La région intergénique (ITS) 16S-23S présente un polymorphisme de taille et de séquence suffisant entre les espèces pour permettre une caractérisation moléculaire de ces bactéries. L'amplification de cette région intergénique par les amorces 16S/2 et 23S/10 a permis de confirmer les genres des bactéries de référence et ceux des isolats de levains. Celle-ci a généré un profil électrophorétique de 3 bandes qui est particulier à l'espèce Lb. sanfranciscensis.

L'amplification de la séquence tARN^ala - 23S/10 suivie d'une digestion enzymatique (PCR-RFLP) par trois enzymes de restriction a généré différents profils de restriction ont montré que, dans les deux échantillons, Lb. sanfranciscensis était l'espèce prédominante. La banque de données informatisée contenant ces profils de restriction a permis une confirmation des résultats d'identification des isolats de levains de panification. L'amplification d'une séquence spécifique de la région rDNA 16S de cette espèce bactérienne a contribué à la validation des résultats obtenus par PCR-RFLP.

Cette étude semble montrer que la farine utilisée pour le rafraîchi des levains n'a pas d'influence sur la flore majoritaire dans les conditions de l'étude. Toutefois, il est nécessaire d'identifier un nombre plus important d'isolats, de tester d'autres types de farine et sur un nombre plus important de rafraîchis.

Mots-clés : Lactobacilles, bactéries lactiques, Lb. sanfranciscencis, levains, panification, PCR-RFLP, ITS, flore lactique.

ABSTRACT

Industries of the fermented cereal products (panification, viennoisery, crackers...) currently have a renewed interest for mixed fermentations the control of this process of mixed fermentation is based on the one hand on the study of the microbial biodiversity of the leavens and on the other hand on the characterization of the flora, in particular, lactic using the biomolecular tools. The objective was to study the biodiversity of the lactic flora of the French leavens of panification and the influence of the standard parameter of flour on the lactic flora, like, the validation of the molecular methods (PCR, PCR-RFLP) of characterization of this flora.

Two French leaven samples were analyzed: a leaven BF refreshed with a flour of the type 70 and one leaven BF refreshed with the flour of bruised grain. The lactic flora of the leaven of panification is made up mainly of bacteria of the Lactobacillus kind. The intergenic area (ITS) 16S-23S has a sufficient polymorphism of size and sequence between the species to allow a molecular characterization of these bacteria. The amplification of this intergenic area by the primers 16S/2 and 23S/10 made it possible to confirm the kinds of the bacteria of reference and those of the leaven isolates. This one generated an electrophoretic profile of 3 bands which is particular with the species Lb sanfranciscensis.

The amplification of the sequence tARNala - 23S/10 followed by an enzymatic digestion (PCR-RFLP) by three enzymes of restriction generated various profiles of restriction showed that, in the two samples; Lb. sanfranciscensis was the prevalent species. The computerized bank of data containing these profiles of restriction allowed a confirmation of the results of identification of the leaven isolates of panification. The amplification of a specific sequence of the area rDNA 16S of this bacterial species contributed to the validation of the results obtained by PCR-RFLP.

This study seems to show that the flour used for refreshed leavens does not have an influence on the majority flora under the conditions of the study. However, it is necessary to identify a more significant number of isolates, to test other types of flour and on a more significant number of refreshed.

Key words: Lactobacilles, lactic acid bacteria, Lb. sanfranciscencis, leavens, panification, PCR-RFLP, ITS, TTGE, lactic flora.