Memoire Online - Caractérisation moléculaire des bactéries lactiques des levains de panification

La caractéristique qui fait l'unité de ce groupe bactérien est la production de l'acide lactique à partir de différents substrats carbonés. En dehors de ce point commun, les nombreux genres et espèces qui constituent ce groupe présentent une grande diversité de caractéristiques morphologiques et physiologiques. Cela se traduit par l'existence au sein des espèces de nombreuses souches possédant des propriétés technologiques différentes. (Desmazeaud 1998).

Ce sont des cellules vivantes, procaryotes et hétérotrophes dont les caractéristiques sont les suivantes: bacilles ou coques gram positif, généralement immobiles, asporulées, aérotolérants, chimiotrophes et ne possèdent ni catalase, ni nitrate-réductase et ni cytochrome oxydase (Stiles et al., 1997 ). Le genre le plus fréquemment isolé des levains est le genre Lactobacillus.

Les lactobacilles sont présent naturellement dans la nature et sont rarement pathogènes. Ce sont des cellules allongées, régulières en forme de bâtonnets ou coccobacilles isolés ou en chaînettes de taille variable, asporogènes, immobiles ou mobiles grâce à des flagelles péritriches, anaérobies facultatifs. Leurs exigences nutritionnelles complexes et leurs températures de croissance (2 à 53°C) sont très variables d'une espèce à l'autre mais elles sont toutes acidophiles avec un pH optimal de croissance de 5,5 a 6,2. Leurs GC% sont de 36 à 47. Leur mode de fermentation est à la base de la subdivision en trois groupes.

-Groupe I: forme de lactobacilles homofermentaires stricts qui ne fermentent que les hexoses par la voie d'Embden-Meyerhof en produisant presque exclusivement du lactate. Ce groupe comprend notamment Lb. acidophilus, Lb. farciminis, Lb. johnsonii, Lb. amylovorus, Lb. paralimentarius (Cai et al., 1999), Lb. delbrueckii subsp. delbrueckii, Lb. delbrueckii subsp. lactis, Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus (Torriani et al., 1999), Lb. nantensis (Valcheva et al., 2006).

-Groupe II: renferme les lactobacilles homo-hétérofermentaires facultatifs qui fermentent les hexoses mais aussi les pentoses en lactate et acétate par la voie d'Embden-Meyerhof. Il s'agit en particulier de Lb. alimentarius, Lb. casei, Lb. curvatus, Lb. plantarum, Lb. graminis, Lb. paracasei, Lb. paraplantarum, Lb. pentosus, Lb. sakei (Stiles et al., 1997). Ces espèces bactériennes sont présentes dans les végétaux fermentés comme l'ensilage et dans les produits carnés et laitiers fermentés.

-Groupe III: forme de lactobacilles hétérofermentaires stricts qui fermentent les hexoses en lactate, acétate (ou éthanol) et CO₂. Les pentoses aussi sont fermentés en lactate et en acétate. Ces Lactobacillus ont un faible pouvoir acidifiant et produisent des substances aromatiques. Il s'agit notamment de Lb. brevis, Lb.buchneri, Lb. fermentum, Lb.hilgardii, Lb.fructivorans, Lb.panis (Wiese et al., 1996) , Lb.pontis, Lb. reuteri, Lb.hammesii (Valcheva et al., 2005), Lb. sanfranciscensis, Lb. spicheri, Lb. kimchii et Lb. frumenti (Müller et al., 2000). Ces espèces se retrouvent dans les levains de panification et les produits laitiers fermentés (Oheix 2003).

La flore bactérienne peut se classer en deux types selon l'âge des levains: la flore des levains jeunes est hétérogène, surtout homofermentaire et d'une minorité hétérofermentaire et la flore des levains plus âgés devient majoritairement hétérofermentaire. Elle comprend en majorité Lb. brevis et Lb. sanfranciscensis (86 à 95 % de la flore totale) (Spicher 1987).

Parmi les effets bénéfiques des levains de panification sur la qualité du pain citons: le retard du rassissement, l'augmentation de l'acidité, la protection contre les moisissures, l'abaissement de l'index glycémique et l'amélioration du flaveur et de la texture (De Vuyst et al., 2002).

La dégradation des protéines est due, soit à l'activité protéolytique bactérienne, soit à l'activation des protéases de la farine en milieu acide. Les bactéries lactiques provoquent une augmentation des protéines solubles dans la pâte et l'apparition de peptides et d'acides aminés qui outre le fait qu'ils stimulent la croissance des microorganismes, interviennent dans la formation de certains composés aromatiques. Par ailleurs, le pH optimal des protéases de la farine étant voisin de 4, l'acidification de la pâte favorise leur activation et la production des acides aminés à partir du gluten (Onno et Roussel 1994). La dégradation du gluten affecte les caractéristiques rhéologiques des pâtes et la texture du pain. Les études ont montré que l'acidification par les acides lactique et acétique change complètement les caractéristiques rhéologiques durant la fermentation (Thiele et al., 2004) et est à l'origine d'une diminution de viscosité et d'extensibilité. Ce changement est prononcé pour un pH allant de 3,8 a 4,1.

L'activité protéolytique dépend des souches bactériennes. Les travaux de Gobbetti et al., en 1996 ont montré que Lb. sanfranciscensis CB1 isolé du levain naturel a une capacité particulière à dégrader les protéines ou les peptides durant la fermentation.

Les espèces suivantes: Lb. sanfranciscensis, Lb. brevis 14G et les souches CRL 759 et CRL 778 du Lb. alimentarius sont potentiellement capables d'hydrolyser la gliadine, la fraction protéique du gluten responsable de la maladie coeliaque (Gobbetti et al ., 2005; Rollan et al., 2005; Di Cagno et al., 2002).

En panification directe, les levures de l'espèce Saccharomyces cerevisiae sont les seuls agents de fermentation. Les levures jouent un rôle important dans la production du gaz carbonique provenant de la dégradation des glucides qui contribue à la levée de la pâte (Onno et Roussel 1994). Les bactéries lactiques homofermentaires produisent seulement de l'acide lactique. Seules les bactéries lactiques hétérofermentaires produisent du gaz carbonique mais comparativement aux quantités produites par les levures, elles contribuent faiblement à la levée de la pâte (Onno et Roussel 1994). Il a été noté que l'association du Lb. sanfranciscensis avec S. cerevisiae et S. exiguus M14 accroissait la production du gaz carbonique en comparaison avec S. cerevisiae seule (Gobbetti et al., 1997).

Les caractéristiques aromatiques du pain font le sujet de plusieurs investigations et plus de 500 composés volatils ont été signalés dans plusieurs types de pains (Gzerny et Schieberle 2002). L'arôme du pain doit être attribué non pas à un seul composé, mais à un mélange complexe de substances aromatiques, d'origine microbienne et enzymatique.

La qualité aromatique du pain au levain dépend du pH de la pâte et du rapport acide lactique/ acide acétique appelé quotient fermentaire. (Czerny et Schieberle 2002 ; Rohrlich 1953).

La fermentation lactique confère aux produits finis un goût typique du pain au levain, aigrelet par l'acide lactique et plus piquant par l'acide acétique. La quantité de chaque acide produite est variable d'un levain à l'autre. On appelle le quotient fermentaire (QF) le rapport molaire des concentrations en acide lactique et acide acétique. Le QF dépend des conditions de fermentation et des espèces présentent dans le levain ou le starter. Pour le pain de levain de froment (farine de blé tendre) caractéristique du pain Français, les valeurs optimales du quotient fermentaire pour définir un bon arôme n'ont pas été déterminées, mais il est préconisé, à titre indicatif, un rapport compris entre 4 et 10. Le pain allemand, plus riche en acide acétique, a un goût acide plus prononcé que celui du pain français. (Onno et Roussel 1994 ; Roussel et Chiron 2002)

Les bactéries lactiques ont un rôle fondamental dans l'inhibition des flores non lactiques, dont certaines sont préjudiciables à la qualité du pain. Cette action est due à l'abaissement du pH (qui inhibe la croissance de la plupart des germes non lactiques), à la toxicité propre de l'acide lactique, mais aussi à la sécrétion de bactériocines (facteurs bactéricides) et des substances antifongiques (Desmazeaud 1998).

A côté des composés comme les acides organiques, le peroxyde d'hydrogène et le diacétyle, les bactéries lactiques des levains inhibent les germes indésirables en produisant des bactériocines comme la plantaricine libérée par Lb. plantarum ST31, des substances dites bactériocines-like (BLIS) comme le BLISC57 de Lb. sanfranciscensis C57 et des antibiotiques comme la reutericycline produite par Lb. reuteri LTH2584 (Gobbetti et al., 2005 Gobbetti et al., 1997).

Des substances comme l'acide phényllactique et l'acide 4-hydroxy-phényllactique isolées des souches de Lb. plantarum 21B et 20B ont montré une activité inhibitrice contre Aspergillus, Penicillium et Monilia. Par ailleurs, une gamme d'acides organiques tels que les acides:

acétique, formique, caproïque, propionique, butyrique et valérique libérées par Lb. sanfranciscensis CB1, possèdent le même effet contre Aspergillus, Fusarium, Penicillium et Monilia. Ces acides agissent d'une manière synergique (Gobbetti et al., 2005 ; Lavermicocca et al., 2003 ).

IV. Les méthodes de caractérisation moléculaire des bactéries lactiques

Pour l'identification de la population microbienne des levains de panification, des méthodes d'analyses basées sur les critères phénotypiques (physiologique et biochimique) et moléculaires (PCR-RFLP, PCR-RAPD, PCR multiplex, PCR avec primers spécifiques des espèces) ont été utilisées (Settani et al., 2005 ; Randazzo et al., 2005 ; Ehrmann et al., 2003 ; Corsetti et al., 2001, Zavaleta et al., 2001, Müller et al., 2000 ; Zapparoli et al., 1997). Ces méthodes ont permis l'identification de la quasi-totalité des bactéries lactiques dans les pains aux levains (De Vuyst et al., 2002 ; Valcheva et al., 2005). Ces méthodes sont basées sur le principe de la PCR (polymerase chain reaction) ou technique d'amplification utilisant l'ADN-polymérase qui permet d'amplifier in vitro une molécule d'ADN en plusieurs millions de copies.

De même, la variabilité dans la longueur et la séquence de la région intergénique 16S/23S ARNr ou ITS (Internal Transcribed Spacer) rend l'étude de cette région intéressante pour identifier la microflore lactique (Tannock et al., 1999). Les ITS sont constitués d'une part de régions très conservées qui sont les séquences codant pour les gènes ARNt d'isoleucine et ARNt d'alanine mais aussi des régions variables utilisables pour l'identification des espèces (Gürtler et Stanisich 1996).

Figure n°1: Positions des régions conservées de l'opéron ribosomique 16S-23S chez Escherichia coli. Les lignes noires représentent la région ISR qui sépare les ARNr 16S et 23S. Cette région contient les deux gènes d'ARNt (ARNt^Ile et ARNt^Ala) (Gürtler et Stanisich 1996).

Parmi les bactéries, il a été démontré que la structure de l'ITS reste stable dans la limite du genre (Kabadjova et al., 2002 ). Les ITS de Lactobacilles se présentent sous la forme de deux copies différentes, l'un qui comprend les gènes tARN^alaet tARN^ile, et l'autre sans ces séquences codantes ce qui explique qu'on observe deux fragments après une amplification de la région 16S/23S (Nour et al., 1998) . Selon Kabadjova et al., 2002, le genre Carnobacterium possède trois types d'opérons ribosomiques. Les bactéries des genres Lactococcus, Leuconostoc, Weissella, Oenococcus et Streptococcus possèdent un seul opéron rrn avec une structure dans l'ordre 5'-16S-seq-tAla-seq-3' qui est visualisée par un seul produit de la réaction. (Le Jeune et Lonvaud-Funel 1997).

L'organisation de l'opéron rrn 5'-16S-23S-5S-3' est montrée par la figure suivante :

C. Carnobacterium (Kabadjova et al., 2002 ; Rachman et al., 2004)

Figure n°2 : Organisation de la région intergénique 16S-23S de l'ARNr chez les bactéries lactiques. La région intergénique est en vert. S-ISR : petit ISR, M-ISR : moyen ISR, L-ISR : grand ISR. A : groupe de C. divergens, C. mobile, C. funditum, C. alterfunditum, C. inhibens, et C. viridans ; B : groupe de C. piscicola et C. gallinarum

La PCR- RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) est une méthode appropriée pour la différenciation des espèces voir les souches des Procaryotes. Dans cette méthode, on compare les profils électrophorétiques de différentes molécules d'ADN digérées par les mêmes enzymes de restriction. On obtient les fragments de restriction. Si les molécules d'ADN que l'on compare sont différentes, leurs sites de restriction le sont aussi; par conséquent, les fragments de restriction obtenus en électrophorèse seront aussi différents (Caillez 2004). La méthode PCR-RFLP de la région ISR a permis l'identification de quatre espèces de Carnobacterium, de certaines souches de Leuconostoc (Rachman et al., 2004 ; Zavaleta et al., 1996) et des bactéries acétiques (Ruiz et al., 2000).

Les endonucléases de restriction souvent utilisées sont signalées dans le tableau suivant:

Tableau n°2: Exemples de quelques enzymes de restriction et leurs séquences de reconnaissance

Enzymes	Source microbienne	Séquence
Hind III	Haemophilus influenzae b	5'- A - A - G - C - T - T - 3' 3'- T - T - C - G - A - A -5'
Hinf I	Haemophilus influenzae Rf	5' - G - A - N - T - C - 3' 5' - C - T - N - A - G - 3'
Taq I		5' - T - C - G - A - 3' 3' - A - G - C - T - 5'

Enfin, la TTGE (Temporal Temperature Gradient Gel Electrophoresis) est une méthode qui utilise une électrophorése en conditions dénaturantes pour détecter la diversité, le suivi dynamique et l'activité des communautés bactériennes dans des différents aliments (Randazzo et al., 2005 ; Meroth et al., 2003 ; Duthoit et al., 2003 ; Ogier et al., 2002, Cocolin et al., 2000, Zoentendal et al., 1998). La TTGE est une forme parallèle de la DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis), où un gradient de température est appliqué au lieu du gradient chimique. La température est la même quelque soit la position sur le gel mais elle change en fonction du temps. Plusieurs fragments de Tm (melting temperature) différentes peuvent donc être séparés sur le même gel de TTGE. Au cours de l'électrophorèse, l'ADN migre d'abord à l'état double brin, puis rencontre des conditions qui dénaturent le domaine de fusion moins stable de la molécule, formant une structure partiellement simple brin, dite ramifiée. Cette structure est formée grâce à l'utilisation de GC clamp, une séquence de guanines (G) et cytosines (C) de 30 à 50 nucléotides, ajoutée et attachée à l'extrémité 5' d'une de deux amorces utilisées. Cette séquence co-amplifiée et introduite dans les fragments amplifiés empêche la dénaturation complète ; l'ADN double brin ne se transforme donc pas en simple brin. Cette dénaturation partielle entraîne une réduction de la mobilité électrophorétique de sorte que sa position finale dans le gel dépend exclusivement de la température de fusion (Tm) du domaine le moins stable. La révélation des fragments sous UV est réalisée en général en utilisant le SYBR Green I comme colorant (agent intercalant). (Rachman 2004 ; Müyzer et Smalla 1998 ; Vasquez et al., 2001).

Figure n°4: Formation d'un brin d'ADN ramifié grâce à la présence de GC clamp. (Rachman et al., 2004)

Cette technique est utilisée dans le but d'étudier l'écologie microbienne. L'extraction de l'ADN bactérien est effectuée directement à partir de la matrice à analyser. L'ADN bactérien d'une région variable V6-V8 est amplifié par PCR et est ensuite soumis à une électrophorése dénaturante par la température. Les fragments obtenus correspondant aux bactéries recherchées peuvent être récupérés et séquencés afin de confirmer leur identité. La technique TTGE permet donc d'obtenir des empreintes électrophorétiques, donc génétiques d'un écosystème microbien. Cette technique a été appliquée par Meroth et al., 2003 à l'étude de la dynamique des flores lactiques de levain de panification.

Caractérisation moléculaire des bactéries lactiques des levains de panification

III. 2: Les bactéries lactiques

IV. Les méthodes de caractérisation moléculaire des bactéries lactiques