Amplification pour le diagnostic moléculaire
d'espèces
La PCR est une technique de réplication in vitro
qui permet à l'aide d'amorces spécifiques d'amplifier un
fragment d'ADN extrait. Pour le diagnostic moléculaire, nous avons
utilisé la méthode de Snounou [33]. Les différentes
étapes de la PCR, ainsi que les différents couples d'amorces sont
consignées dans les tableaux 2 et 3 ci-dessous :
Tableau 2:
Séquences des amorces utilisées pour le diagnostic
moléculaire et tailles des bandes attendues
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Espèces
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Amorces
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Séquences des amorces (5'-3')
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Tailles attendues (pb)
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Plasmodium spp.
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rPLU5
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CCTGTTGTTGCCTTAAACTTC
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1100
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rPLU6
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TTAAAATTGTTGCAGTTAAAACG
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P. falciparum
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rFAL1
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TTAAACTGGTTTGGGAAAACC AAATATATT
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205
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rFAL2
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ACACAATGAACTCAATCATGA CTACCCGTC
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P. vivax
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rVIV1
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CGCTTCTAGCTTAATCCACAT AACTGATAC
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120
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rVIV2
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ACTTCCAAGCCGAAGCAAAGA AAGTCCTTA
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P. ovale
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rOVA1
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ATCTCTTTTGCTATTTTTTAG TATTGGAGA
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800
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rOVA
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GGAAAAGGACACATTAATTGT ATCCTAGTG
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P. malariae
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rMAL1
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ATAACATAGTTGTACGTTAAG AATAACCGC
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144
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rMAL2
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AAAATTCCCATGCATAAAAAA TTATACAAA
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Tableau 3: Programme PCR
utilisés
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Réaction
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Conditions de PCR
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PCR1 (P. falciparum, P. vivax, et P.
malariae)
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Dénaturation : 95°C pendant 5minutes, et
94°C pendant1 min, hybridation à 60°C pendant 2 min, et
extension à 72°C pendant 2 min (30 cycles)
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PCR1 (P. ovale)
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Dénaturation : 95°C pendant 5minuteset
94°C pendant 30 s, hybridation à 45°C pendant 30 s, et
extension à 72°C pendant 1 min 30 s (30 cycles)
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Nested -PCR (P. falciparum, P. vivax, et
P. malariae)
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Dénaturation : 95°C pendant 5minutes et
94°C pendant 1 min, hybridation à 55°C pendant 2 min, et
extension à 72°C pendant 2 min (30 cycles)
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Nested- PCR (P. ovale)
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Dénaturation : 95°C pendant 5minutes et
94°C pendant 30 s, hybridation à 45°C pendant 30 s, et
extension à 72°C pendant 1 min 30 s (45 cycles)
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Le milieu réactionnel contient : 0,024U de Taq
polymérase, du tampon1X (composition en annexe), 1,5mM de Mgcl2, 0,2mM
de dNTPs 0,8mM d'amorce direct et 0,8mM d'amorce reverse. Dix microlitres
(10ìL) d'ADN extrait ont été rajoutés au milieu
réactionnel pour la PCR1. Pour la deuxième PCR, le même
milieu réactionnel est utilisé, mais l'on rajoute 2ìl
d'amplicons de la première PCR. La réaction est effectuée
dans un thermocycler Bio Rad® (Mercure de coanette, France). Les fragments
d'ADN amplifiés sont analysés par électrophorèse
sur gel d'agarose à 2%.
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