I.7. DOSAGE DES ENZYMES
Les tests de dosage de l'activité enzymatique sont
principalement réalisés par les chercheurs pour détecter
la présence d'une enzyme donnée ou la quantifier dans un
organisme, un tissu ou un échantillon. Il existe une multitude de
réactifs et de techniques qui permettent d'étudier les
interactions entre des enzymes et des substrats donnés. Le choix d'une
solution de dosage adaptée dépendra de la sensibilité
attendue par le chercheur. Si les solutions colorimétriques sont utiles
pour la détection, les réactifs fluorescents sont mieux
adaptés à la quantification de l'activité enzymatique.
I.7.1. DÉTERMINATION DES
CONDITIONS OPTIMALES À L'ACTIVITÉ ENZYMATIQUE
Selon BADIN, si de nombreux dosages enzymatiques sont
décrits dans la littérature, il est nécessaire de modifier
ces procédures pour s'adapter aux particularités de l'enzyme
étudiée. L'activité propre à une enzyme
dépend de nombreux facteurs, notamment le pH, la température, la
force ionique et la concentration de tous les constituants du test. Pour des
conditions comme le pH, l'activité enzymatique suit souvent à une
courbe en cloche. L'activité maximale à un pH donné et
notée Vmax et on observe une décroissance de l'activité
aux deux extrémités de la courbe. Certaines enzymes peuvent
nécessiter la prise en compte d'autres facteurs pour des composants non
directement impliqués dans la réaction, comme les ions
métalliques, les détergents et les molécules hydrophobes.
(Badin, 2013)
A. Méthodes cinétiques
directes
La mesure de la vitesse de la réaction est
effectuée de façon continue. En fait, la variation d'un signal
est appréciée dans des temps très rapprochés. Cette
façon d'opérer permet de calculer, dans de bonnes conditions, la
pente de la droite correspondant à la vitesse de la réaction.
Seules quelques méthodes analytiques sont adaptées à cette
mesure directe dans le milieu réactionnel. Ce sont essentiellement la
spectrophotométrie d'absorption dans le visible et l'ultraviolet, la
spectrofluorimétrie, la turbidimétrie, la conductimétrie,
la potentiométrie et la polarographie. (Badin, 2013)
1. Spectrophotométrie
d'absorbtion
La spectrométrie d'absorption est une méthode de
spectroscopie électromagnétique utilisée pour
déterminer la concentration d'une substance en mesurant
l'intensité du rayonnement électromagnétique qu'elle
absorbe à des longueurs d'onde différentes. (Badin, 2013)
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