III.2.1.4.2. Les tests de transposition in vivo :
Ces tests ont pour objectif l'obtention de réponses
directes concernant l'activité ou non d'une transposase de type
mariner. Ces tests sont réalisées à l'aide des
bactéries co-transfomées par deux plasmides ; un plasmide
contenant un pseudotransposon et un autre portant le gène de la
transposase. Si la transposase est active, elle peut exciser et
réinsérer le pseudotransposon. En cas où, la
réinsertion est effectuée en aval d'un promoteur, des
événements de transposition peuvent être détectables
par un système de sélection spécifique (In Halaimia Toumi,
2006). (Figure 21).
Figure 22 : Les différents
étapes permettant la construction de vecteur porteur de
gène
da la transposase (D'après Halaimia Toumi, 2006).
ITR5'
Etape1 : Amplification du gène de la transposase
cloné dans du pGEMT par PCR
en utilisant les amorces 1 et 2. et représentent les
séquences des sites
de restriction des enzymes E1 et E2 respectivement
Etape 4 : Clonage dans un vecteur d'expression
préalablement digéré à l'aide des
enzymes E1 et
E2
E1 E2
Etape 2 : Clonage dans pGEMT pour vérification au
séquençage
Amorce 1 Amorce 2
pGEMT
Etape3 : Digestion avec les enzymes de restriction E1 et E2
ATG Gène transposase TCA
Vecteur d'expression pGEMT
pGEMT
pGEMT
ITR3'
Selon la figure, les bactéries résistantes
à la tétracycline résultent de la transposition du
gène de la tétracycline en aval d'un promoteur, pour effectuer ce
test, il faut passer par les étapes suivantes :
III.2.1.4.2.1. Construction des vecteurs permettant
l'expression de la transposase mariner : (Figure 22)
Deux types de vecteurs sont utilisés :
Un plasmide pMAL c2 : (déjà
décrit dans la partie ) Il permet l'expression de la transposase en
fusion avec la MBP via un promoteur lacI inductible à l'IPTG,
la transposase sera produite sous une forme fusionnée ce qui facilite sa
purification par une réaction d'affinité, ce vecteur porte un
gène de résistance à l'ampicilline
Un plasmide pBADR : Il permet l'expression de la
Tnp via un promoteur inductible à l'arabinose et possède aussi un
gène de résistance à l'ampicilline.
Les deux vecteurs seront digérés par des
endonucléases de restriction, et le gène de la transposase sera
amplifié par PCR, des nucléotides seront additionnés aux
amorces de polymérisation afin de reconstituer des sites d'enzymes de
restriction aux extrémités 5' et 3', ces sites correspondent aux
sites de restrictions connus par les enzymes utilisées pour la digestion
des deux vecteurs. Enfin le gène de la transpsase sera
inséré dans les vecteurs d'expression par ligation en utilisant
une DNA ligase. (In Halaimia Toumi, 2006).
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