III.2.1.4.2.2. La construction de plasmide pBC KS(+)
contenant le pseudo transposon :
Le pseudo-transposon est le gène de la
résistance à la tétracycline (TetR) sans son
promoteur, flanqué par un ITR en position 5' et 3'. Les ITRs double brin
peuvent être produits par hybridation d'un ITR simple brin up et
un ITR simple brin down, et c'est en ajoutant des
oligonucléotides qui constituerons après hybridation des sites de
restriction, ces derniers permettent le clonage des ITRs dans le plasmide pBC
KS(+) (Figure 23), trois constructions différentes peuvent être
constituées dont chacune contient une combinaison des ITRs
différents (Figure 24), les ITRs à insérer seront
digérées par les mêmes enzymes de restrictions
utilisées pour la digestion du vecteur (In Halaimia Toumi, 2006).
Figure 23 : Les différentes
étapes de construction du vecteur pBC KC (+) porteur
du
pseudotransposon. (D'après Halaimia Toumi, 2006)
pBC
Chl r
Tet r
Chl r
Chl r
Tet r
Double digestion par
HindIII et Xba I
Double digestion par
KpnI et XhoI
Double digestion par
NotI et SacI
Chl r
Tet r
Tet r
Chl r
Chl r
Tet r
Chl r
Figure 24 : Les différentes
constructions de pBC porteur de pseudo-transposon
réalisées
(D'après Halaimia Toumi, 2006)
ITR 3' en position 5'
ITR 5'
ITR 5' ITR 3'
Codon stop Codon ATG
Codon stop
Codon stop
pBC 5T5
Tet.R
pBC 3T3
Chl r
Tet.R
Tet.R
Chl r
Chl r
Codon ATG
Codon ATG
ITR 5'en position 3'
ITR 3'
III.2.1.4.2.3. Réalisation des tests de
transposition in vivo :
Les bactéries co-transformées par les deux
plasmides construits précédemment seront mises en culture, puis
sélectionnées sur des boites LB-tétracycline. Dans les
clones contenant le plasmide pMAL, la transcription de la trasposase sera
induite par l'IPTG, tandis que celle des clones contenant le plasmide pBAD sera
induite par l'arabinose. Le taux de transposition est calculé par le
rapport :
Nombre de bactéries sur les boites
LB-tétracycline
Nombre de bactéries sur les boites LB
Les clones qui présenteront une résistance
à la tétracycline seront analysés par extraction de leurs
plasmides et ses linéarisations à l'aide d'une enzyme de
restriction pour la vérification de l'existence d'un tel
évènement de transposition. La résistance à la
tétracycline peut être expliquée par le
fait que la transposase a effectuée l'intégration du
pseudo-transposon en aval d'un promoteur qui doit être du
côté du codon ATG du gène de la tétracycline (In
Halaimia Toumi, 2006).
Augé Gouillou et al., (2001) ont mis en
évidence une activité de transposition in vivo avec la
transposase Mos1, le taux de cette transposition était variable
avec les constructions utilisées dont la construction 3T3 a
manifesté le meilleur taux (3.2×10-5). Ils ont
également montré que la transposition était
inter-plasmidique car la transposition dans le génome bactérien
n'a pas été observée (Figure 25) (Augé Gouillou et
al., 2001).
TA
TA
AT AT
Figure 25 : Une représentation
schématique de la transposition inter-plasmidique obtenue avec la
transposase Mos1 au cours des tests de transposition in vivo,
la transposase assure le transfert du pseudo-transposon en l'insérant
dans son site cible qui se duplique au cours de l'insertion et qui est
porté par le gène du chloramphénicol. (d'après
Augé Gouillou et al., 2001).
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