4. 2. 3. Identification moléculaire par PCR-RFLP
de l'ADNr 16S
L'amplifiat a été préparé dans un
volume final de 25 ul en utilisant les amorces rd et fd selon le prototole
mentionné dans le tableau 5. L'amplification a été
réalisée dans un thermocycleur (Biometra TRIO-Thermoblock) selon
le programme approprié (Tableau 6).
La vérification de l'amplification a été
réalisée par électrophorèse horizontale sur un gel
d'agarose 0,9 % (Sigma medium EEO type II) à 100V pendant 30 min dans le
tampon TAE 1X (Tris Acétate EDTA). Le gel a été
coloré au BET (1ug/ml d'eau distillée) et visualisé sous
UV (312 nm) au Biodoc (Biodoc 2NT/Biometra). Le Felix-500 pb Ladder a
été utilisé comme marqueur standard de taille (Annexe
3).
Les fragments amplifiés ADNr 16S avec des amorces non
marquées, ont été digérés par l'enzyme de
restriction MspI (Invitrogen) dans un volume de 15 pl
à 37 °C pendant 3 h. La discrimination a été
réalisée aussi par NdeII (Invitrogen). La digestion a
été réalisée sur 8 ul de l'amplifiat
mélangé avec 1 ul d'une enzyme de restriction à site de
coupure tetranucléotidique (5U/ul), dans un volume équivalent de
tampon (0,9 tampon + 0,1ul BSA (10mg/ml)). La réaction a
été arrêtée après incubation à
65°C pendant 10 min pour inactiver l'enzyme de restriction. La
séparation des fragments d'ADN digérés a été
réalisée par migration électrophorétique sur gel
d'agarose (QA-Agarose, Q-Biogène), à une concentration
de 3 % (m/v) dans un tampon TAE 1X (Tris-acétate 40 mM, EDTA 1 mM).
Tableau 5: Quantités et réactifs
utilisés pour l'amplification de l'ADNr 16S et de la séquence
Rep-PCR.
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Réactifs
|
ADNr 16S
|
Rep-PCR
|
|
Amorce 1
|
0,1 uM
|
0,5 (50mM)
|
|
Amorce 2
|
0,1 uM
|
0,5 (50mM)
|
|
Tampon 10x
|
1x
|
-
|
|
Tampon Giescher (5 mM)
|
-
|
1,5ul
|
|
dNTP
|
20 uM
|
0,625 (25 mM)
|
|
MgCl2 (50 mM)
|
1,5 mM
|
1,75 ul
|
|
Taq pol
|
0,025U/ul
|
0,025U/ul
|
|
ADN
|
3 ul
|
3 ul
|
|
H2O Milli-Q stérile
|
25 ul
|
0,5ul
|
|
BSA (1,7mg)
|
-
|
1,25ul
|
Le marqueur de poids moléculaire Smart ladder
(échelle de 200 à 10000 pb) ou Smart ladder low 20 pb
(échelle de 20 à 1000 pb, Eurogentec) a été
utilisé comme standard de taille. Les ADNs ont été
visualisés par fluorescence aux UV après imprégnation au
BET (1 cg/ml). La taille en paire de base des
différentes bandes obtenues a été évaluée
par comparaison à celles des marqueurs moléculaires
utilisés à l'aide du logiciel PM, Macintoch, Vs 4,0.
Tableau 6: Cycles de variation des
températures au cours de l'amplification des différents
gènes.
Réactions ADNr16S Rep-PCR
|
Dénaturation Dénaturation Hybridation Extension
Extension finale
|
1x: 95°C, 3mn
35x: 94°C, 1mn
55°C,
1mn
72°C, 2mn
1x: 72°C, 3mn
|
1x: 94°C, 3 min
35x: 94°C, 3 min
40°C, 1
min
65°C, 8 min
1x: 65°C, 8 min
|
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