4. 2. Caractérisation moléculaire
4. 2. 1. Extraction de l'ADN bactérien
A partir d'une boîte de pétri, contenant des
colonies pures de chaque isolat, une colonie a été
repiquée sur milieu Yeast Extract-Tryptone (TY) (Beringer, 1974)
gélosé incliné (Annexe 1) et incubée à
28°C pendant 48 heures. Après avoir ajouté 8 ml d'eau
Milli-Q stérile, les bactéries ont été mises en
suspension. Une centrifugation de 7 minutes a été
effectuée et le culot est re-suspendu dans 50ul d'eau Milli-Q et soumis
à une deuxième centrifugation de 3 minutes. Au culot, il a
été ajouté 100 ul de tampon tris HCl 10 mM à pH
8,3; 100 ul d'eau distillée stérile; et 17ul de PK
(Protéinase K 1 mg/ml). Le mélange a été ensuite
incubé à 55°C pendant 12 heures. L'arrêt de la
digestion a été provoqué après ébullition
pendant 10 min.
4. 2. 2. Evaluation de la diversité
génétique des isolats de la collection par Rep-
PCR
Dans la technique Rep-PCR, les amorces sont conçues
pour s'hybrider d'une façon complémentaire aux
extrémités des séquences répétitives
inversées; de telle manière que la PCR permet l'amplification de
toute la séquence localisée entre les sites d'hybridation des
amorces. L'amplification génère ainsi différents fragments
d'ADN de tailles variables.
Par séparation électrophorètique, ces
fragments permettent la révélation d'une empreinte
génétique spécifique (Versalovic et al., 1991; De
Bruijn, 1992) à chacune des 45 isolats de la collection.
Les réactions d'amplification ont été
réalisées selon une optimisation du protocole décrit
initialement par De Bruijn (1992). L'amplification a été
effectuée dans des micro-tubes de 100 pl contenant 30
pl de volume final de réaction. Le mélange
réactionnel comprend le tampon de réaction au 1/10 du volume
final et qui contient 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, et 0,1 % Triton X-100; 1 mM de
chaque desoxyribonucléoside triphosphate (dNTP); 5 mM MgCl2; 3
pl de diméthylsulfoxyde (DMSO) à 10 %; 1
pl de bovine serum albumin (BSA) à 10 mg/ml;
30 pmol de chaque amorce; 2U de la Taq polymérase et 2
pl du lysat d'ADN. Les deux amorces palindromiques
utilisées pour amplifier les séquences répétitives
Rep sont Rep 1 et Rep 2.
Après addition des échantillons d'ADN des 45
isolats, les micro-tubes ont été placés dans un
thermocycleur. Un micro tube dont l'ADN a été remplacé par
de l'eau bi-distillée stérile est utilisé en tant que
témoin négatif.
Les mélanges ont été alors soumis au
processus d'amplification établi par Grundmann et al. (1997)
selon le programme Rep-PCR (Tableau 5).
A la fin de l'amplification, un aliquote de 15
jtl de chaque amplifiat a été
mélangé avec 2jil de bleu de Bromophénol
(BBE). Les différents mélanges ont été soumis
à une électrophorèse horizontale sur gel d'agarose (Sigma
Ultra Pure) à 1,5% dans le tampon Tris, Acétate, EDTA (TAE)
(Annexe 4) pendant trois heures à 80V. Le 100 pb et le 1Kb step
ladder (Promega) ont été utilisés comme marqueurs de
poids moléculaire lors de chaque migration effectuée. Le gel a
été coloré dans une solution de bromure d'éthidium
à 1 mg/ml pendant 20 à 25 min, rincé dans de l'eau
distillée pendant 3 min, puis placé sous UV au Biodoc pour
être photographié.
La taille en paire de base des différentes bandes
obtenues a été évaluée par comparaison à
celles des marqueurs moléculaires utilisés à l'aide du
logiciel PM, Macintoch, Vs 4,0.
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