Diversités phénotypique et moléculaire des microsymbiotes du Sulla du nord (Hédysarum Coronarium L. ) et sélection de souches rhizobiales efficientes

4. 2. 4. Séquençage du gène de l'ADNr 16S

La détermination du statut taxonomique des souches de sulla étudiées par le séquençage du gène de l'ADNr 16S précisera si ces souches constituent une nouvelle espèce parmi les rhizobiums.

L'ADN 16S est purifié avec le kit Gene Elute PCR cleaning up Kit, et le gène est préparée pour le séquençage en mélangeant 8 à 10 pmol/100 pb d'ADN avec 3 ul du Sequencing reaction mix (Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems)) et 3,2 pmol du primer et le volume est ajusté à 10 ul avec de l'eau Milli-Q stérile.

Les réactions de séquençage de l'ADN ont été réalisées selon la méthode de Sanger, à l'aide du kit Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) selon les recommandations du fournisseur. Les produits des réactions de séquence ont été ensuite purifiés sur des colonnes Sephadex AutoSeq G-50 (Amersham Pharmacia Biotech). L'électrophorèse capillaire a été effectuée sur un séquenceur automatique ABI PRISMTM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).

Les séquences nucléotidiques ont été ensuite comparées aux séquences contenues dans les banques de données à l'aide du logiciel Blast (Basic Local Alignment Search Tool, www.ncbi.nlm.gov/blast). Le logiciel Clustal W ( www.infobiogen.fr) a permis l'alignement des séquences.

4. 2. 5. Analyse numérique

Les similarités entre les différentes souches analysées ont été évaluées par comparaison des profils de restriction prises deux à deux. Une matrice bidimensionnelle a été construite sur la base de ces profils. Les distances génétiques calculées selon UPGMA ont permis la construction d'un dendrogramme mettant en évidence les relations génétiques existantes entre les différentes souches analysées.