4. Etude de la diversité des microsymbiotes du
sulla
Dans le but d'étudier la diversité des
microsymbiotes du sulla, nous avons procédé à une
caractérisation phénotypique puis moléculaire des isolats
de la collection.
4. 1. Caractérisation phénotypique
Les caractères phénotypiques permettent de
sélectionner des souches efficientes, compétentes et
indifférentes aux divers stress environnementaux.
4. 1. 1 Infectivité des isolats
La capacité d'induire la formation de nodosités
sur les racines de la légumineuse hôte est un critère de
base pour l'authentification des isolats. De ce fait, la capacité
infective des 50 isolats a été évaluée par la
présence de nodosités sur les racines du sulla
variété Bikra 21.
4. 1. 1. 1. Désinfection des graines et
semis
Les graines ont été stérilisées
par lavage à l'hypochlorite de sodium à 1% pendant 8 minutes
suivie d'un lavage de 15 secondes avec de l'alcool à 95° puis d'une
série de 7 rinçages à l'eau distillée
stérile. Les graines ont été mises sur milieu de
germination gélosé agar-agar 0,9 % et placées à
l'obscurité à 4°C pendant 48 heures; puis elles ont
été déplacées dans un incubateur à
l'obscurité et à 25°C pendant 3 à 5 jours.
Les graines ayant une radicule d'environ 0,5 cm (Figure 7) ont
été transférées aseptiquement dans des pots de
volume 33 cl remplis de sable stérile (stérilisation à
l'étuve: 200°C pendant 48 h) à raison d'une graine par
pot.
Les pots ont été ensuite placés dans une
chambre de culture à température, humidité et
photopériode contrôlées respectivement 25°C, 36%, et
16 h lumière /8 h obscurité.
Radicule
Figure 7: Germination des graines de sulla sur
milieu gélosé agar-agar 0,9 %.
4. 1. 1. 2. Inoculation des plantes et conduite de la
culture
Une colonie bactérienne de chaque isolat a
été introduite dans un milieu YEM liquide et mise en agitation
à 150 tr/min à 28°C dans des conditions d'obscurité.
Après 48 h, quand la solution est devenue trouble (108
bactéries/ml); chaque plante a été inoculée par 1
ml de la suspension bactérienne. Trois pots contenant chacun une seule
plante ont été utilisés pour chaque souche. Après
inoculation, les pots ont été couverts avec du papier aluminium
stérile pour éviter d'éventuelles contaminations (Figure
8).
Des plantes non inoculées ont été
utilisées comme témoin (T0). Les plantes ont été
arrosées 3 fois par semaine alternativement avec de la solution
nutritive dépourvue d'azote (Vadez et al., 1996) (Annexe 2) et
de l'eau distillée stérile.
Figure 8: Test d'infectivité des souches
de la collection en association avec Hedysarum coronarium L. et en
conditions contrôlées.
Après 8 semaines de culture, l'infectivité des
souches a été évaluée par la présence de
nodules sur les racines de l'ensemble des 3 plantes. Les plantes ayant au moins
une nodulation positive sur l'ensemble des 3 répétitions sont
maintenues pour une ultérieure caractérisation morphologique et
moléculaire.
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