4. 1. 2. Critères morphologiques
4. 1. 2. 1. Coloration Gram
Afin d'identifier les bactéries isolées, on a
procédé à une coloration Gram permettant de mettre en
évidence les propriétés de la paroi bactérienne. Le
principe de cette méthode consiste en la fixation de la solution
bactérienne à la chaleur à environ 40°C pendant 10
minutes puis à la réalisation d'une série de colorations
(Coloration par le violet de gentiane (1 min); mordançage au lugol (20
sec); décoloration à l'alcool (20 sec); et recoloration à
la fuchsine (1 min)). Enfin l'observation du frottis au microscope
(grossissement 1000) permet selon la couleur de la paroi de différencier
entre les bactéries Gram + et Gram-.
4. 1. 2. 2. Caractérisation morphologique des
colonies
Après purification des bactéries selon la
technique de Vincent (1970) et incubation à 28°C pendant 4 à
5 jours, une analyse visuelle de l'aspect des colonies a été
faite comme celle décrite par Jordan (1982). Les critères choisis
sont relatifs à la forme, la taille et la consistance des colonies.
4. 1. 3. Critères physiologiques des
colonies
Les critères physiologiques testés se sont
limités aux plus importants facteurs de stress abiotique en Tunisie.
Parmi ces facteurs la tolérance aux stress hydrique, salinité, pH
et calcaire a été évaluée pour l'ensemble des
souches de la collection ayant présenté au moins une nodulation
positive par répétition.
Les tolérances aux facteurs de stress ont
été effectuées par culture des souches en milieu liquide
dans des flacons contenant 5 ml d'une solution YEM liquide et inoculée
par une pré-culture en phase exponentielle. Trois
répétitions ont été réalisées pour
chaque type de stress.
Après une incubation à 28°C pendant 5 jours
en agitation (150 rpm), la limite de tolérance aux différents
stress a été évaluée par mesure de la
densité optique (DO) à 620 nm.
4. 1. 3. 1. Tolérance à la
salinitéLa tolérance des souches au sel a
été effectuée sur milieu YEM gélosé et
liquide en
augmentant la concentration en NaCl par palier de 50 mM. Les
teneurs ont varié de 100 à 1000 mM.
4. 1. 3. 2. Tolérance au stress
hydrique
La méthodologie suivie pour l'évaluation de la
tolérance au stress hydrique osmotique des bactéries est la
même que celle appliquée pour la tolérance au sel (Buss
et al., 1989). Le produit utilisé à ce propos est le
polyéthylène glycol (PEG 6000). Les potentiels osmotiques
testés sont -0,25 ; -0,5 ; -0,9 ; -0,95 et -1MPa.
4. 1. 3. 3. Tolérance au pH basique
Hedysarum coronarium L. est une plante adaptée
aux sols argilo-calcaires. Ces sols se distinguent par un pH basique
d'où l'initiative d'étudier la tolérance des souches aux
pH alcalins.
Les souches ont été évaluées pour
leur tolérance aux pH alcalins sur YEM liquide additionné d'une
solution NaOH 5N. Le pH a été ajusté aux valeurs
suivantes: 7; 7,5; 8 ; 8,5 ; 9; 9,5; 10 ; 10,5; 11; 11,5 et 12.
4. 1. 2. 3. Tolérance au calcaire
La capacité des souches à tolérer le
stress calcaire a été évaluée sur milieu
gélosé YEM additionné de rouge Congo (RC), renfermant des
teneurs croissantes en CaCO3: 0,5 M ; 1M ; 1,5M et 2M.
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