III.7.2- Dosage
Le piégeage du radical superoxyde
(O2·-) peut être effectué par un mélange de
tampon phosphate 50 mM (pH 7,5) contenant de l'EDTA (Ethylene diamine
tetraacetic) (0,05 mM), hypoxanthine (0,2 mM), 63 uL NBT( Nitro-Blue
Tétrazolium) (1mM), 63 uL de l'extrait aqueux ou éthanolique (eau
distillée pour la contrôle), et 63 de l' uL xanthine oxydase
(1,2U/uL).
23
Chapitre II- Méthode d'étude d'activité des
antioxydants des plantes médicinales
La xanthine d'oxydase a été ajoutée en
dernier. Le taux de la réduction du NBT a été
déterminé par la lecture de l'absorbance
spectrophotométriques à 560 nm (PAREJO et al., 2002).
Les résultats sont exprimés en pourcentage
d'inhibition de la NBT par rapport au tampon selon la formule suivant :
(Cabs-CBabs) - (Sabs-SBabs)
Inhibition % = ×100
(Cabs - CBabs)
Cabs : L'absorbance de l'échantillon.
CBabs : L'absorbance du blanc.
Sabs : L'absorbance de témoin.
SBabs : L'absorbance du blanc de témoin (PAREJO et
al., 2002).
II.8- Test ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity)
II.8.1- Principe
La mesure ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) permet de
déterminer si une source organique possède un effet antioxydant
en le comparant à un analogue de la vitamine E : le trolox. Dans cet
essai, l'AAPH (2.2'-azobis-2-aminopropane dihydrochloride) est utilisé
comme source génératrice de radicaux peroxyles. L'addition de
fluorescéine comme sonde fluorescente permet de quantifier, à
l'aide d'une analyse spectrophotométrique, en fonction du temps, la
perte de fluorescence associée à la réaction avec les
radicaux libres fournit par l'AAPH par un mécanisme de transfert d'atome
d'hydrogène. La présence d'antioxydants empêche ou ralenti
la perte de fluorescence qui est calculée par l'aire sous la courbe en
fonction du temps. Celle-ci peut être détectée à une
longueur d'onde d'excitation de 485 nm et d'émission de 520 nm. Il
s'agit donc d'une méthode permettant de mesurer la capacité
antioxydant contre les radicaux peroxyles (OU et al., 2001). Lorsqu'un
capteur de radicaux libres est incorporé dans le
24
Chapitre II- Méthode d'étude d'activité des
antioxydants des plantes médicinales
milieu, les radicaux libres sont captés, et la
fluorescence persiste, donnant ainsi une idée précise du pouvoir
anti-radical libre, donc antioxydant de l'échantillon (ROLLAND,
2004).
(AUC échantillon- AUC blanc) x (molarité du
standard)
Valeur relative ORAC =
(AUC standard-AUC blanc) x (molarité de
l'échantillon)
AUC = Aire sous la courbe (ROLLAND, 2004).
II.8.2- Dosage
Ce dosage est basé sur la génération de
radicaux libres en utilisant AAPH (2,2 -azo-bis -2 amidopropane dichlorhydrate)
et mesure de la diminution de la fluorescence en présence des capteurs
des radicaux (PIRIOR et al., 2003). Dans cet essai,
f3-phycoérythrine (f3 -PE) a été utilisé comme
piégeages des radicaux libres cible, AAPH comme un radical peroxyle
générateur et Trolox comme un contrôle standard.
après addition de AAPH à la solution d'essai, la fluorescence est
enregistrée et l'activité antioxydant est exprimée en
équivalent Trolox (CAO et al., 1993 ; FREI et
al., 1990).
Le dosage peut être effectué selon la PIRIOR et
al. (2003) dans des plaques à 96 puits de fluorescence de
polypropylène avec un volume finale de 200 uL. Les analyses sont
effectuées à pH 7,0 avec de Trolox (6,25, 12,5, 25, et 50 umol/ L
pour les dosages lipophiles ; 12,5, 25, 50 et 100 umol /L pour les dosages
lipophiles hydrophile) et 75 mM / L du tampon phosphate comme le blanc.
Après l'addition de l'AAPH, la plaque est placée
immédiatement dans un compteur à Multilabel
préchauffé à 37 C°. La plaque est
agitée pendant 10 s et la fluorescence est lue à des intervalles
de 1 min pour 35 min à la longueur d'onde d'excitation de 485 nm et une
longueur d'onde d'émission de 520 nm. L'aire sous la courbe est
calculée pour chaque échantillon en utilisant le logiciel Wallac
Workout 1.5. Le calcul final des résultats a été
déterminé dans la partie linéaire de la courbe du -
désintégration entre blanc et de l'échantillon et / ou
standard (Trolox). Les résultats sont exprimés en LM
d'équivalents Trolox (TE) par g de poids sec de l'échantillon (IM
TE / g) (NUR ALAM et al., 2012).
25
Chapitre II- Méthode d'étude d'activité des
antioxydants des plantes médicinales
| 
