II.1.2- Dosage
L'activité du piégeage du radical DPPH a
été mesurée selon le protocole décrit par
LOPES-LUTZ et al. (2008)(ATHAMENA et al., 2010). 50ìl
de chaque solution méthanolique des extraits à différentes
concentrations sont ajoutés à 1,95 ml de la solution
méthanoïque du DPPH (0,025g/l). Parallèlement, un
témoin négatif est préparé en mélangeant
50ìl de méthanol avec 1,95 ml de la solution méthanolique
de DPPH. La lecture de l'absorbance est faite contre un blanc
préparé pour chaque concentration à 515nm après 30
min d'incubation à l'obscurité et à la température
ambiante. Le contrôle positif est représenté par une
solution d'un antioxydant standard; l'acide ascorbique dont l'absorbance a
été mesuré dans les mêmes conditions que les
échantillons et pour chaque concentration (BOUGANDOURA, 2013).
17
Chapitre II- Méthode d'étude d'activité des
antioxydants des plantes médicinales
Les résultats sont exprimés en tant
qu'activité anti-radicalaire ou l'inhibition des radicaux libres en
pourcentages (I %) en utilisant la formule suivante:
I % = [1 - (Abs Échantillon - Abs Contrôle
négatif)] x 100
I %: Pourcentage de l'activité anti-radicalaire (AAR%).
Abs Échantillon : Absorbance de l'échantillon.
Abs Contrôle négatif : Absorbance du contrôle
négatif (MEDDOUR, 2013).
II.2- Test de la réduction du fer FRAP (Ferric
reducing-antioxidant power)
II.2.1- Principe
Le pouvoir réducteur du fer (Fe3+) dans les
extraits est déterminé selon la méthode décrite par
OYAIZ (1986) (BOUGANDOURA, 2013). La méthode de la réduction du
fer est basée sur la réduction de fer ferrique en sel de fer par
les antioxydants qui donnent la couleur bleu (OU et al., 2001) selon
la figure 10.
Figure 10- Schéma sur la réaction
de test FRAP (Ferric reducing antioxidant power) (PRIOR et
al., 2005).
18
Chapitre II- Méthode d'étude d'activité des
antioxydants des plantes médicinales
TPTZ : ferric2,4,6-tripyridyl-s-triazine.
Fe2+: Ions ferreux.
Fe3+ : Ions ferriques (PRIOR et al.,
2005).
II.2.2- Dosage
Un millilitre de l'extrait à différentes
concentrations (de 0,007à 2,5mg/ml) est mélangé avec 2,5ml
d'une solution tampon phosphate 0,2 M (pH 6,6) et 2,5ml d'une solution de
ferricyanure de potassium K3Fe(CN)6 à 1%. L'ensemble est incubé
au bain-marie à 50°C pendant 20 min ensuite, 2.5ml d'acide
trichloracétique à 10% sont ajoutés pour stopper la
réaction. Les tubes sont centrifugés à 3000 rpm pendant
10min. Un aliquote (2,5ml) de surnageant est combinée avec 2,5ml d'eau
distillée et 0,5ml d'une solution aqueuse de FeCl3 (Chlorure ferrique)
à 0,1%. La lecture de l'absorbance du milieu réactionnel se fait
à 700 nm contre un blanc semblablement préparé, en
remplaçant l'extrait par de l'eau distillée qui permet de
calibrer l'appareil (spectrophotomètre UV-VIS). Le contrôle
positif est représenté par un standard d'un antioxydant; l'acide
ascorbique dont l'absorbance a été mesuré dans les
mêmes conditions que les échantillons. Une augmentation de
l'absorbance correspond à une augmentation du pouvoir réducteur
des extraits testés (SINGLETON et ROSSI, 1965).
Le pourcentage de pouvoir réducteur de fer est
calculé par la réaction suivant :
Pouvoir réducteur de fer (%) = [{Ao - A1/ Ao}] X 100.
Ao : est l'absorbance de FeCl3.
A1 : est l'absorbance de FeCl3 solution en présence de
l'extrait (GHAISAS et al., 2008).
19
Chapitre II- Méthode d'étude d'activité des
antioxydants des plantes médicinales
II.3- Méthode de TRAP (Total radical-trapping
antioxidant parameter) II.3.1- Principe
Cette méthode est basée sur la protection
fournie par les antioxydants sur la décroissance de la fluorescence de
la R-phycoérythrine (R-PE) au cours d'une réaction de
peroxydation contrôlée. La fluorescence de R-phycoérythrine
est désactivée par ABAP (2,2' - azo-bis (2 - amidino- propane) de
chlorhydrate en tant que générateur de radicaux. Ce stoppage de
la réaction est mesuré en présence d'antioxydants. Le
potentiel antioxydant est évalué en mesurant la
décroissance de la décoloration selon GHISELLI et al.
(1995) (NUR ALAM et al., 2013).
| 
