2-9-Détermination de quelques paramètres
cinétiques
Pour la détermination des constantes de
Michaelis et Menten (KM) et des vitesses maximales
(Vmax) des enzymes purifiées
(á-glucosidase, â-glucosidase et
â-galactosidase), la méthode de
Lineweaver et Burk (1934) a été utilisée.
Les concentrations des substrats chromophores
p-nitrophényl-D-glycosides se sont situées entre 0,1 et 20
mM tandis que celles des di et oligosaccharides ont varié entre 0,1 et
20 mM. Les valeurs de KM et Vmax obtenues ont permis de calculer les
efficacités catalytiques (KM/Vmax) des enzymes.
2-10-Actions des agents chimiques sur l'activité
hydrolytique
L'enzyme a été pré-incubée pendant
10 min à 37 °C dans un milieu réactionnel de 175 ul de
tampon acétate 100 mM (pH optimum d'hydrolyse de la glycosidase
étudiée) contenant 1 mM ou 0,1 % (m/v) d'agent chimique.
Après cette pré-incubation, 75 ul de pNP-gycoside 5 mM y
ont été ajoutés pour une incubation de 10 min à 37
°C au bain marie. La réaction a été
arrêtée par ajout de carbonate de sodium 1 M. L'intensité
de la coloration du milieu réactionnel a été
mesurée au spectrophotomètre à 410 nm par rapport à
une solution témoin contenant tous les produits exceptée
l'enzyme. Dans chaque cas, l'activité enzymatique a été
exprimée en pourcentage de l'activité obtenue en l'absence de
produits chimiques.
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2-11-Réactions de transglycosylation
2-11-1-Milieu réactionnel
Les réactions de synthèse enzymatique de
néoglycoconjugués ont été réalisées
à 37 °C dans 2 ml d'un mélange réactionnel contenant
du tampon acétate 100 mM ou phosphate 100 mM, et une quantité
appropriée de solution enzymatique (12 UI), des concentrations variables
de donneurs (50 à 800 mM) de glycosyle (maltose, saccharose, cellobiose
et lactose) et d'accepteurs de glycosyle (25 à 600 mM)
(phényléthanol). Les cinétiques de réactions de
synthèse ont été suivies à différents temps
entre 1 et 48 h par prélèvement de 0,2 ml de parties aliquotes.
La réaction a été arrêtée par chauffage des
parties aliquotes prélevées au bain-marie bouillant pendant 5
min.
2-11-2-Analyse chromatographe des produits de
transglycosylation
Les parties aliquotes prélevées ont
été filtrées sur une membrane hydrophile 0,2 um
(Sartorius). Les produits issus des réactions de transglycosylation ont
été analysés quantitativement et qualitativement par
chromatographie liquide à haute performance (Spectra system)
après injection de 20 ul du filtrat.
L'analyse des sucres a été
réalisée grâce à un détecteur
refractomètre et une colonne Supelcosyl LC-NH2 5 um (0,46 × 25 cm)
de Supelco. La phase mobile a été un mélange
acétronitrile/eau (75/25 ; v/v). Le débit d'écoulement a
été maintenu à 0,75 ml/min. Le xylose est utilisé
comme étalon interne. Quant aux hétérosides
(néoglycoconjugués synthétisés), leur analyse a
été suivie grâce à un détecteur (spectra
system) UV à 257 nm. La phase mobile a été le
mélange méthanol/eau (35/65, v/v). Un débit
d'écoulement de 0,45 ml/min a été appliqué. La
colonne utilisée a été l'Hypersil 5 um (0,46 × 25 cm)
de Shandom. La tyrosine a été utilisée comme étalon
interne.
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