2-7- Influence du pH sur les activités
glycosidasiques
2-7-1- Détermination du pH optimum
d'hydrolyse
Les pH optima d'hydrolyse des
p-nitrophényl-glycosides ont été
déterminés dans les tampons acétate 100 mM (pH 3,6
à 5,6) et phosphate 100 mM (pH 5,6 à 8,0). Les activités
enzymatiques ont été déterminées dans les
conditions standard.
2-7-2-Détermination de la stabilité au pH
La stabilité au pH des enzymes a été
testée en préincubant chaque préparation enzymatique
pendant 2 h à 37 °C dans les tampons acétate et phosphate
100 mM pour des valeurs de pH comprises entre 3,6 et 8,0. Les activités
glycosidasiques ont été déterminées dans les
conditions standard.
2-7-3-Influence de la force ionique
L'influence de la force ionique sur les activités des
glycosidases a été mesurée dans les conditions standard.
Les forces ioniques testées ont été celles des tampons
acétate 20 mM, 50 mM et 100 mM contenant du KCl 300 mM.
2-8-Influence de la température sur les
activités glycosidasiques
2-8-1-Détermination de la température
optimale d'hydrolyse, du Q10 et de l'énergie d'activation
L'effet de la température sur les activités
catalytiques des glycosidases a été déterminé
à différentes températures (35 à 80 °C) dans
le tampon acétate 100 mM pH 5 ou pH 5,6. Le Q10 a été
déterminé entre 30 et 40 °C pour
l'á-glucosidase et entre 40 et 50 °C pour la
âgalactosidase et la â-glucosidase. Le graphe
d'Arrhénius a été obtenu dans l'intervalle de 25- 40
°C pour l'á-glucosidase et 30-50 °C pour la
â-glucosidase et la
â-galactosidase.
2-8-2-Inactivation thermique
Pour évaluer le degré de stabilité de
chaque enzyme, celle-ci a été pré-incubée à
37 °C ou à sa température optimale d'hydrolyse dans le
tampon acétate 100 mM au pH optimum d'hydrolyse de l'enzyme
étudiée. A chaque 10 min, une partie aliquote de 50 ul a
été prélevée et refroidie à la
température ambiante pendant 10 min. Elle a été
utilisée pour le déclenchement de la réaction dans les
conditions standard.
2-8-3-Dénaturation thermique
Les différentes solutions enzymatiques diluées
dans un tampon acétate 100 mM (pH optimum d'hydrolyse de la glycosidase
étudiée) ont été pré-incubées pendant
10 min aux températures allant de 30 à 80 °C, puis
refroidies à la température ambiante. Les activités
résiduelles ont été déterminées dans les
conditions standard.
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