2-6-Détermination des propriétés
moléculaires
2-6-1- Détermination des masses
moléculaires par gel filtration
Pour la détermination des masses moléculaires
des glycosidases purifiées à homogénéité
électrophorétique, des protéines de
référence ont été utilisées. Ce sont : la
âamylase (MM= 200 kDa), le sérum albumine bovine (MM= 66 kDa),
l'ovalbumine (MM= 45 kDa) et le cytochrome C (MM= 12,4 kDa). Ces
protéines ont été chargées séparément
sur la colonne TSK (7,8 mm × 15 cm). La phase mobile utilisée a
été le tampon acétate de sodium 100 mM contenant de
l'azide de sodium (0,5 % , m/v). Le débit de la chromatographie a
été de 30 ml/h. Il a été maintenu constant
grâce à une pompe péristaltique de marque GILSON. Des
fractions de 1 ml ont été collectées. Le temps
d'élution de chaque protéine a été inscrit sur le
chromatogramme. Connaissant les masses moléculaires des
différentes protéines de
référence et leur temps d'élution, la
courbe des masses moléculaires en fonction des temps d'élution a
pu être tracée. Cette courbe d'étalonnage a permis de
déterminer les masses moléculaires de
l'á-glucosidase, de la
â-glucosidase et de la
â-galactosidase de la larve du charançon
Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) connaissant leurs temps
d'élution.
2-6-2- Détermination des masses moléculaires
par électrophorèse
sur gel de polyacrylamide en présence de
SDS
L'électrophorèse sur gel de polyacrylamide en
présence de dodécyle sulfate de sodium (SDS-PAGE) a
été réalisée selon la méthode de
Laemmli (1970). Les enzymes, dans un tampon Tris-HCl 125 mM pH
6,8 contenant du SDS (10 %, m/v), du â-mercaptoéthanol (1 %, v/v),
du glycérol (20 %, m/v) et du bleu de bromophénol (0,025 %, m/v),
ont été dénaturées par un traitement thermique
à l'eau bouillante (5 min). Dans ces conditions, les protéines se
dissocient en leurs sous-unités en fixant de grandes quantités de
détergent (environ 1,4 g de détergent par gramme de
protéine), ce qui masque complètement la charge naturelle de la
sous-unité protéique et lui confère une charge nette
négative. Plus les molécules sont volumineuses, plus la charge en
SDS est importante, ce qui signifie que la mobilité
électrophorétique d'une molécule dépend de sa
taille (poids moléculaire). L'électrophorèse sur gel de
polyacrylamide en conditions dénaturantes (SDS-PAGE) des trois enzymes
purifiées à partir de la larve du charançon
Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) a été
réalisée sur des plaques de gel d'acrylamide (7 x 8 cm).
L'épaisseur du gel a été de 1,5 mm. Il contient 12 %
d'acrylamide, du tampon Tris-HCl 375 mM (pH 8,8) et du S.D.S (10 %, m/v). Une
fois polymérisée, le gel a été
transféré sur un dispositif HOEFFER SCIENTIFIC INSTRUMENT (Mighty
Small II Unit) et refroidi par une circulation d'eau.
L'électrophorèse a été réalisée avec
un courant électrique de 15 mA dans le tampon de migration Tris (25
mM)/glycine (192 mM) contenant du S.D.S (0,1 %, m/v). Des marqueurs Bio-Rad de
faibles poids moléculaires [Phosphorylase B (91.000 Da), le sérum
albumine bovine (66 kDa), l'ovalbumine (49,9 kDa), l'anhydrase carbonique (35,1
kDa), l'inhibiteur trypsique de soja (28,4 kDa) et le lysozyme (20,8 kDa)] ont
été utilisés.
Les protéines ont été
révélées au nitrate d'argent (Blum et
al., 1987) ou au bleu de Coomassie R-250, (0,1 % , m/v) ;
solution contenant du méthanol (40 %, v/v) et de l'acide acétique
(10 %, v/v). La décoloration a été réalisée
par lavages successifs dans le mélange méthanol/ acide
acétique/ glycérol/eau (20/7/3/70, v/v/v/v).
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