2-5-2- Fractionnement au sulfate d'ammonium
A l'extrait enzymatique obtenu après chromatographie
sur DEAE Sepharose CL-6B, une quantité correspondante de sulfate
d'ammonium a été lentement ajoutée selon la méthode
de Dawson et al. (1969) sous agitation
mécanique à 4 °C de sorte à obtenir une saturation
à 80 %. Après 12 h de précipitation des protéines,
ce mélange a été centrifugé à 6000 trs/min
pendant 30 min à 4 °C dans une centrifugeuse
réfrigérée (UNICEN ALRESA). Le culot
obtenu a été resuspendu dans 1 ml de tampon acétate 100 mM
pH 5,6 ou pH 5,0.
2-5-3-Chromatographie d'exclusion moléculaire sur
gel de Sephacryl S-100 HR
Cette chromatographie permet la séparation des
molécules en fonction de leur poids moléculaire et de leur volume
hydrodynamique. Le gel Sephacryl S-100-HR permet de séparer les
macromolécules globulaires ayant des poids moléculaires compris
entre 10 et 100 kDa. Il a été coulé dans une colonne en
verre (1,6 x 64 cm) et ensuite équilibré avec du tampon
acétate 100 mM pH 5,6 ou pH 5,0. Les protéines ont
été éluées avec ce même tampon après
le dépôt de l'extrait brut enzymatique (1 ml) issu de la
précipitation au sulfate d'ammonium à 80 % de saturation. Le
débit de la chromatographie a été de 15 ml/h et maintenu
constant grâce à une pompe péristaltique de marque GILSON.
Des fractions de 1 ml ont été collectées et les plus
actives « poolées » pour la suite de la purification.
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2-5-4-Chromatographie d'interaction hydrophobe sur gel de
Phényl-Sepharose CL-4B
La chromatographie d'interaction hydrophobe permet de
séparer les molécules en fonction de leur hydrophobie et de leur
caractère amphiphile. La colonne a un diamètre de 1,4 cm pour une
hauteur de 5 cm. Le débit d'élution de 14 ml/h a
été fixé par l'intermédiaire d'une pompe
péristaltique de marque GILSON. Des fractions de 1 ml ont
été recueillies. La solution enzymatique, saturée avec du
thiosulfate de sodium (1,7 M), a été déposée sur la
colonne Phényl-Sepharose CL 4B préalablement
équilibrée avec du tampon acétate 100 mM pH 5,6 ou pH 5,0
contenant du thiosulfate de sodium 1,7 M. Après avoir lavé 3 fois
la colonne avec ce même tampon, les protéines retenues ont
été éluées par application d'un gradient en palier
décroissant de thiosulfate de sodium (1,7 ; 1 ; 0,5 ; 0,3 ; 0,2 ; 0,1 ;
0 M ) préparé dans le tampon acétate 100 mM au pH optimum
correspondant à chaque activité glycosidasique (pH 5,6 pour les
activités á-glucosidasiques et
â-galactosidasique et pH 5,0 pour l'activité
â-glucosidasique). Dans chaque cas, les fractions les
plus actives ont été « poolées». Les solutions
obtenues contenant les enzymes purifiées à
homogénéité électrophorétique ont
été dialysées contre le tampon acétate 100 mM pH
5,6 ou pH 5,0 pendant plus de 12 h.
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