2-3- Dosage de l'activité pNP-glycosidasique
Dans les conditions standard, l'activité
pNP-glycosidasique a été mesurée dans 275 ul de
tampon acétate 100 mM pH 5,6 ou pH 5,0 contenant 1,25 mM de
pNP-glycoside et 50 ul de solution enzymatique. Le mélange
réactionnel a été incubé dans un bain marie
à 37 °C pendant 10 min. La réaction a été
arrêtée par alcalinisation du milieu réactionnel avec 3 ml
de carbonate de sodium 1 M. La quantité de
p-nitrophénolate libéré a été
mesurée au spectrophotomètre à 410 nm avec pour
témoin une solution ne contenant pas d'enzyme. L'activité
enzymatique a été exprimée en micromole de
p-nitrophénolate libéré par min.
L'activité spécifique est exprimée en unité
enzymatique par mg de protéine (UE/mg).
2-4- Dosage des protéines
Deux méthodes ont été utilisées pour
déterminer les teneurs en protéine. Il s'agit de celles
décrites par Lowry et al. (1951) et
Bradford (1976).
2-4-1- Méthode de Lowry et al.
(1951)
Les teneurs en protéine des solutions enzymatiques ont
été dosées selon la méthode de Lowry et
al. (1951). Les protéines réagissent avec le
réactif de Folin-Ciocalteus (un mélange de tungstate et de
molybdate de sodium en solution dans l'acide phosphorique et l'acide
chlorhydrique) pour donner des complexes colorés. La couleur ainsi
formée est due à la réaction du phosphomolybdate par la
tyrosine et le tryptophane. L'intensité de la coloration dépend
donc de la quantité d'acides aminés aromatiques présents
et varie selon les protéines. Les densités optiques sont
mesurées à 600 nm avec pour témoin une solution contenant
tous les réactifs exceptées les protéines. Cette
méthode permet de doser des concentrations de protéine qui
varient de 5 à 100 ug.ml-1 (Pelmont,
1995).
2-4-1-1- Réactif utilisés
Solution A : réactif de Folin-Ciocalteus dilué de
moitié dans la soude 0,1N ;
Solution B : carbonate de sodium (2 %, m/v) préparé
dans la soude 0,1N ;
Solution C1 : sulfate de cuivre (0,5 % , m/v)
préparé dans de l'eau distillée ;
Solution C2 : tartrate double de sodium et de potassium (1% ,
m/v) préparé dans de l'eau distillée ;
Solution D : préparée extemporanément
à partir de 100 ul de solution C1, 100 ul de solution C2 et 10 ml de
solution B.
2-4-1-2- Technique de dosage
Deux cent (200) ul de préparation protéique ont
été dilués dans 2 ml de solution D. Ensuite, 200 ul de
solution A ont été ajoutés à ce mélange. Le
milieu réactionnel a été agité et laissé
reposer pendant 30 min à l'obscurité pour permettre le
développement de la coloration. La densité optique de l'essai a
été mesurée à 600 nm avec pour témoin une
solution ne contenant pas de solution protéique. La densité
optique obtenue a été ensuite convertie en mg
426
de protéine grâce à une droite
d'étalonnage préparée dans les mêmes conditions. Le
sérum albumine bovine a été utilisé comme
protéine de référence.
2-4-2- Méthode de Bradford (1976)
La technique de Bradford (1976) a
été utilisée pour doser les faibles quantités de
protéine dans la solution enzymatique. Elle utilise du bleu de Coomassie
G250 dont la forme leuco (brun orange) est convertie en forme bleue
caractéristique du complexe formé entre les groupements
NH3+ des protéines et ce réactif. Elle permet de doser
des quantités de protéine de l'ordre du microgramme.
2-4-2-1- Réactif utilisés
Le réactif de Bradford est un mélange
homogène de bleu de Coomassie G 250 (0,060 g), d'acide perchlorique (3
g), de chlorure de sodium (2,92 g), et d'eau distillée psp (100 ml).
2-4-2-2- Technique de dosage
L'extrait protéique contenant une quantité de
protéine comprise entre 2 à 25 ug a été
dilué dans le réactif de Bradford selon le
rapport (1:1, v/v). Après le mélange, l'intensité de la
coloration a été déterminée au
spectrophotomètre à 595 nm avec pour témoin une solution
contenant tous les réactifs excepté l'extrait protéique.
La droite d'étalonnage obtenue dans les mêmes conditions a permis
de convertir la densité optique en quantité de protéine.
Le sérum albumine bovine a été utilisé comme
protéine de référence.
2-5- Purification des enzymes
Trois enzymes ont été purifiées. Ce sont
: l'á-glucosidase, la
â-glucosidase et la
âgalactosidase de la larve de charançon
Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) du palmier Elaeis
guinensis. Dans chacun des cas, la purification a été faite
en trois étapes chromatographiques comportant une chromatographie
échangeuse d'anion, un fractionnement sur gel d'exclusion
moléculaire et une chromatographie d'interaction hydrophobe.
2-5-1- Chromatographie d'échange d'anion sur
D.E.A.E Sepharose CL-6B
Le gel DEAE (diéthylaminoéthyle) Sepharose CL-6B
est un échangeur anionique. Il a été coulé dans une
colonne en verre (2,4 x 6,5 cm) et équilibré dans un tampon
acétate 100 mM pH 5,6. Le débit chromatographique a
été de 14 ml/h et maintenu constant par l'intermédiaire
d'une pompe péristaltique de type GILSON. Le gel est lavé avec
120 ml du même tampon. Les protéines retenues par le gel ont
été décrochées par un gradient en palier croissant
de KCl préparé dans le tampon acétate de sodium 100 mM pH
5,6. Des fractions de 4 ml sont collectées et les plus actives ont
ensuite été « poolées » pour la suite de la
purification.
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