2-1-1- Préparation de la solution de DNS
Deux (2) g de DNS et 3,2 g de soude ont été
dissous dans 70 ml d'eau distillée. Ensuite, 60 g de tartrate double de
sodium-potassium ont été progressivement ajoutés à
ce mélange sous chauffage et agitation. Le volume de ce mélange a
été complété à 100 ml avec de l'eau
distillée.
2-1-2- Technique de dosage
Dans les conditions standard, l'activité
polysaccharidasique a été mesurée dans 0,8 ml de tampon
acétate de sodium 100 mM pH 5,0 ou pH 5,6 contenant 1 % (m/v) de
polysaccharide et 100 ul de solution enzymatique.
Le milieu réactionnel a été incubé
à 37 °C pendant 30 min dans un bain-marie. Ensuite, 500 ul de
solution de DNS y ont été ajoutés. Le mélange a
été homogénéisé et chauffé au
bain-marie bouillant pendant 5 min. La densité optique a
été mesurée au spectrophotomètre à 540 nm
contre un témoin contenant les réactifs à l'exception de
la solution enzymatique. La quantité de sucres réducteurs
libérés a été déterminée à
l'aide d'une courbe d'étalonnage réalisée dans les
conditions expérimentales. L'activité enzymatique se
définit comme étant la quantité d'enzyme catalysant
l'hydrolyse d'une micromole de substrat par min dans les conditions standards.
L'activité spécifique a été exprimée en
unité enzymatique par mg de protéine (UE/mg).
2-2- Dosage de l'activité oligosaccharidasique
Certains oligosaccharides sous l'action des enzymes
fournissent du glucose. La quantité de glucose libéré peut
être dosée selon la méthode de Kunst et
al. (1984) utilisant le réactif glucose
oxydase-péroxydase.
2-2-1- Préparation du réactif glucose
oxydase-péroxydase
Ce réactif a été constitué d'un
mélange de deux solutions A et B préparées
extemporanément. La solution A a été obtenue par
dissolution de 0,6 mg de glucose oxydase et 0,24 mg de péroxydase dans
60 ml de tampon phosphate 100 mM pH 7,0. La solution B a
été constituée d'o-dianisidine (6,6
mg/ml) préparée dans 0,6 ml de tampon phosphate 100 mM pH 7,0.
2-2-2- Technique de dosage
Pour le dosage de l'activité oligosaccharidasique,
l'essai standard contient 10 mM d'oligosaccharide et 50 ul de solution
enzymatique dans un volume final de 250 ul de tampon acétate 100 mM pH
5,0 ou pH 5,6. Le mélange réactionnel a été
incubé pendant 10 min à 37 °C. La réaction
enzymatique est arrêtée par chauffage du milieu réactionnel
pendant 5 min au bain marie bouillant. Trois (3 ml) du réactif glucose
oxydase-péroxydase ont été ajoutés au milieu
réactionnel pour doser la quantité de glucose
libéré. Le nouveau mélange, bien
homogénéisé, a été placé à
l'obscurité (à la température ambiante) pendant 30 min.
L'intensité de la coloration a été mesurée au
spectrophotomètre à 436 nm contre un témoin ne contenant
pas d'enzyme. Une courbe d'étalonnage obtenue dans les mêmes
conditions a permis de convertir les densités optiques en micromoles de
glucose.
Pour déterminer la quantité de xylose
libérée dans le milieu réactionnel, la méthode
chromatographique a été utilisée.
L'activité enzymatique se définit comme
étant la quantité d'enzyme catalysant l'hydrolyse d'une micromole
de substrat par min dans les conditions standards. L'activité
spécifique a été exprimée en unité
enzymatique par mg de protéine (UE/mg).
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